0   引言

微小RNA(microRNA, miRNA)是长度在22个核苷酸左右(19~25 nt)的非编码RNA，多数对基因表达水平发挥负向调控作用^[1]。研究证实，肿瘤组织包括肝癌可释放miRNA至外周血，其种类、含量与肿瘤有一定关系^[2]，所以循环miRNA的检测对于肿瘤诊断和预后监测具有良好的前景，如血浆miR-34a可作为食管癌的诊断标志物，miR-199有潜力成为肝癌患者的诊断标志物^[3]。由于循环miRNA检测具有非侵入性以及检测方便等优点，近年来循环miRNA的检测在临床的应用价值受到越来越多的关注^[4]。

miRNA检测方法多样，包括微阵列芯片、RNA深度测序、实时定量PCR(qRT-PCR)等技术，其中qRT-PCR由于操作简单且价格便宜得到广泛应用^[5]。Poly(A)加尾法qRT-PCR技术是检测miRNA表达的常用方法之一，然而由于血清miRNA含量低，需要较高敏感度的检测方法，Poly(A)加尾法在血清miRNA检测仍有待于进一步改善^[6-7]。

S-poly(T) plus法基于Poly(A)加尾法进行改良，利用特异性引物和探针，将加尾法和反转录cDNA同步进行，具有检验时间更短、重复性更好、敏感度更高等特点^[8]，研究表明S-poly(T) plus法检测肺动脉高压和缺氧治疗相关miRNA具有更高的敏感度^[8-9]，但该方法在检测肝癌相关miRNA方面是否有优势尚且未知。因此，我们以检测与肝癌密切相关的miR-199为例，比较S-poly(T) plus法与Poly(A)加尾法检测肝癌患者血清和健康人miR-199的结果，对S-poly(T) plus法进行方法学评价，为血清miRNA定量检测提供高敏感度和高稳定性的快速检测方法。

1   资料与方法

1.1   资料

选择2017年8月—10月福建医科大学附属第一医院初诊为肝癌患者血清标本15例和年龄、性别与患者相匹配的体检健康者(各项体检结果正常，无乙肝携带及肝功能障碍)血清标本50例，该研究经福建医科大学伦理审查委员会同意，所有患者均签署知情同意书。

1.2   主要试剂及实验仪器

主要试剂：RNA提取试剂盒(康为世纪北京生物技术有限公司，CW0581)，S/P RNAiso kit(深圳今发展生物有限公司，No. AB-MIS-001)、miRNA cDNA合成试剂盒(康为世纪北京生物技术有限公司，CW2141)，miRNA Poly(A)检测试剂盒(康为世纪北京生物科技有限公司，CW2142)。

主要实验仪器：低速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发公司，L500-A)，台式高速冷冻离心机(香港力康公司，Neofuge 23R)，超净工作台(香港力康公司，AlphaClean 1300)，磁力加热搅拌器(常州国华仪器公司，78-1)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司，7500)。

1.3   方法

1.3.1   血清RNA提取

按照RNA提取试剂盒说明书操作步骤，提取总RNA。

1.3.2   引物设计与合成

使用miRBase数据库查找miRNA的序列，利用Primer Premier6.0软件进行引物设计，于上海生工有限公司合成，见表 1。cel-miR54为预混于miRNA提取试剂RNAiso中的Spiked-in RNA，作为miRNA定量检测的内参。

表  1  qRT-PCR反应引物及探针

Table  1  qRT-PCR primers and probes

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1.3.3   miRNA检测

S-poly(T) plus法：如文献^[8]所述，取500 ng总RNA，首先利用S-Poly(T) plus法特异性反转录引物合成cDNA，加Poly(A)尾和反转录同时进行，反应条件：37℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃ 5 min。使用miR-199特异上游引物及下游通用引物完成qPCR。扩增条件：预变性95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。

poly(A)加尾法：取500 ng总RNA，进行poly(A)加尾，poly(A)加尾反应条件为37℃ 15 min，混匀Poly(A)加尾反应液，利用随机引物反转录合成cDNA，反应条件为：42℃ 50 min，85℃ 5 min。用miR-199特异上游引物及下游通用引物进行qPCR。扩增条件：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。

1.4   统计学方法

采用Graph prism 6软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2   结果

2.1   临床资料

本实验中，共有15例初次确诊的肝癌患者纳入实验组，肝癌患者及健康对照者临床资料见表 2。

表  2  肝癌和健康对照者临床资料

Table  2  Clinical characteristics of liver cancer patients and healthy controls

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2.2   检测血清miR-199的敏感度比较

分别用S-poly(T) plus法和Poly(A)加尾法对50例健康者血清miR-199进行检测，扩增曲线，见图 1，其Ct值分析结果，见图 2。S-poly(T) plus法检测miR-199的Ct值较Poly(A)加尾法显著性降低(30.32±0.72 vs. 35.42±0.67, P < 0.0001)，说明S-poly(T) plus法的敏感度较高。

图  1  S-poly(T) plus法(A)和Poly(A)尾法(B)qRT-PCR检测miR-199扩增曲线

Figure  1  Amplification curves of S-poly(T) plus qRT-PCR method(A) and Poly(A) qRT-PCR method(B) for miR-199

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图  2  S-poly(T) plus法和Poly(A)加尾法qRT-PCR测定miR-199的Ct值

Figure  2  Ct values of S-poly(T) plus qRT-PCR method and Poly(A) qRT-PCR method for miR-199

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2.3   检测miR-199线性关系的比较

随机选取1例肝癌患者血清miR-199标本(初始浓度约450 ng/μl)按照10¹、10²、10³和10⁴的倍数进行梯度稀释，分别用两种方法检测梯度稀释的血清miR-199浓度，并分别计算S-poly(T) plus和Poly(A)加尾法的线性相关系数，见图 3。同时再随机选取2例肝癌患者血清样本，进行上述重复实验，分别计算出R²值，发现S-poly(T) plus线性相关系数显著大于Poly(A)加尾法(0.9843±0.0047 vs. 0.9573±0.0045, P=0.0027)，说明S-poly(T) plus法检测血清miR-199线性关系更好。

图  3  S-poly(T) plus法(A)和Poly(A)加尾法(B)qRT-PCR分别检测同1例肝癌患者血清miR-199的线性梯度关系比较

Figure  3  Comparison of linear gradient relation between S-poly(T) plus qRT-PCR method(A) and Poly(A) qRT-PCR method(B) for detecting serum miR-199 from the same patients

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2.4   检测血清中miRNA重复性的比较

取同一份标本进行miR-199检测重复5次，计算其变异系数(coefficient of variation, CV)，CV=标准差/均数×100%。S-poly(T)plus法的CV值为2.59%，Poly(A)加尾法的CV值为3.52%，可见在重复性上，S-poly(T) plus法优于Poly(A)加尾法(P=0.010)，见表 3。

表  3  S-poly(T) plus法和Poly(A)加尾法RT-PCR检测血清中miR-199重复性的比较

Table  3  Comparison of repeatability between S-poly(T) plus qRT-PCR method and Poly(A) qRT-PCR method for miR-199

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2.5   检测肝癌患者与健康体检者的血清miRNA

随机选取10例原发性肝癌患者和10例健康者的miR-199表达水平进行检测，并且以合成的外源cel-miR-54-5p为对照。Poly(A)加尾法检测结果显示患者与健康者血清miR-199差异无统计学意义(P=0.107)，而S-poly(T) plus法检测发现肝癌患者miR-199的Ct值显著降低(P < 0.0001)，提示S-poly(T) plus法在检测肝癌患者miR-199具有更好的敏感度，见图 4。在原来10例的基础上增加5例肝癌患者和相对应的健康者作为对照，共计15例肝癌患者和15例健康者进行S-poly(T) plus法和S-poly(T)加尾法检测血清miR-199水平。两种方法检测结果肝癌患者血清miR-199水平均显著高于健康者，但S-poly(T) plus法检测结果差异更为显著(P < 0.0001 vs. P=0.0041)，见图 5。综上所述，S-poly (T) plus法检测肝癌患者外周血血清的miR-199敏感度较Poly(A)加尾法更好。

图  4  S-poly(T) plus法(A)和Poly(A)加尾法(B)qRT-PCR检测肝癌患者与健康人的血清miR-199相对表达水平

Figure  4  Relative expression levels of miR-199 in liver cancer patients and healthy controls detected by S-poly(T) plus qRT-PCR method(A) and Poly(A) qRT-PCR method(B)

HC: healthy controls; LC: liver cancer patients; Ct: Cycle threshold.

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图  5  S-poly(T) plus法(A)和Poly(A)加尾法(B)qRT-PCR检测15例肝癌患者与15例健康人的miR-199相对表达水平

Figure  5  Relative expression levels of miR-199 in 15 liver cancer patients and 15 healthy controls detected by S-poly(T) plus qRT-PCR method(A) and Poly(A) qRT-PCR method(B)

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3   讨论

原发性肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，每年有超过80万例的新发病例和死亡病例。早期发现肝癌，术后五年生存率可提高至70%，因此肝癌的早期诊断以及早期治疗对患者的治疗效果具有重要意义^[10]。目前常用于诊断肝癌的方法是影像学检测和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)。然而在肝癌早期，依靠影像学和AFP的检测常常导致肝癌漏诊^[11-12]。血清miRNA稳定性高，与疾病相关性较好，在肝癌的早期临床诊断方面具有巨大的应用前景^{[2, 8]}。

本研究通过对比试验发现，S-poly(T) plus法检测miR-199平均Ct值显著低于Poly(A)加尾法，即S-poly(T) plus法具有更好的敏感度，这是因为Poly(A)加尾法用的是通用oligo引物，而S-poly(T) plus法在反转录时使用的是能够与对应的miRNA牢固地互补结合的特异性引物，这将大大增强与目的miRNA分子结合的热稳定性和锚定力度，从而使反转录效率更高，大幅提高目的miRNA第一链cDNA的合成和qPCR效率，使扩增产物增多^[8]。同时S-poly(T) plus法稳定性显著优于Poly(A)加尾法，具有更好的重复性，在临床样本检测中更具有可靠性。此外，该方法同时进行Poly(A)加尾和反转录，简化操作、缩短时间，提高了实验效率。利用S-poly(T) plus法检测与肝癌密切相关的血清miR-199时，发现S-poly(T) plus法检测结果差异更显著，更容易区别肝癌患者和健康体检者血清标本，本团队前期基础利用ROC曲线分析外周血miR-199a诊断肝癌的临床价值，发现当△Ct截断值为1.02时，其敏感度和特异性分别为91.7%和62.0%^[13]。以上结果说明S-poly(T) plus法在肝癌血清miRNA检测具有一定的临床应用价值。另一方面，文献表明肝炎和肝硬化的患者miR-199存在下降的现象，暗示肝炎和肝硬化患者会一定程度影响到此方法的准确性^[14]。

然而，S-poly(T) plus法也有其缺陷，由于运用的反转录引物为特异性的，因此不能像Poly(A)加尾法一样一次性进行所有miRNA合成cDNA，每一个miRNA都要进行一次反转录反应，虽然提高了实验敏感度和特异性，但是降低了实验效率和增加了实验成本。同时在本实验中只针对miR-199，还需要对肝癌相关的其他血清miRNA进行研究。所以S-poly(T) plus法虽然在检测肝癌血清miRNA具有更好的敏感度和稳定性以及一定的临床应用价值，但是有待进一步研究解决提高其实验效率和降低实验成本。

综上所述，S-poly(T) plus法利用特异性反转录引物进行特定miRNA的反转录和PCR反应，较普通的加尾法有更好的敏感度，在肝癌血清特定miRNA的检测有着巨大的应用前景。