0   引言

肺癌是临床中常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)是其常见亚型，包括腺癌和鳞癌等多种类型^[1-2]。近年来研究发现，化疗药物可提高大部分肺腺癌患者的生存率，例如紫杉醇、吉西他滨等，但由于大部分肿瘤会发生转移、侵袭和化疗耐药，导致肿瘤患者5年生存率仍较低^[3]。由此可见，研究肺腺癌对化疗药物的耐药机制，找出增加化疗药物敏感度的方法是目前需要解决的难点。目前，学者们发现第二线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspases, SMAC)是存在于线粒体中并调节细胞凋亡的蛋白质，通过消除凋亡抑制蛋白家族(IAPs)功能进而促进细胞凋亡^[4-5]。诸多研究表明^[6]，SMAC高表达可促进乳腺癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌等肿瘤细胞的凋亡。还有研究^[7]证实，SMAC与肾细胞癌、结直肠癌及肺癌的进展呈负相关。但目前关于SMAC表达对肺腺癌的耐药性的报道较少。研究证实^[8]，Bcl-2/Bax信号通路介导多种肿瘤细胞凋亡，其中Bax和Bcl-2分别为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白；Bcl-2可通过抑制caspase-3的活性进而抑制细胞凋亡，Bax可通过激活caspase-3活性导致细胞不可逆凋亡^[9]。本研究旨在基于caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路探究SMAC基因对肺腺癌细胞紫杉醇敏感度及细胞活性的影响。

1   材料与方法

1.1   细胞株

人肺腺癌细胞株A549和人支气管上皮正常细胞株BEAS-2B均购自中国医科大学附属盛京医院中心实验室。

1.2   试剂与仪器

SMAC基因全长cDNA真核表达载体pcDNA-SMAC、pcDNA-NC空白载体、siRNA-SMAC慢病毒载体、siRNA-NC空病毒载体均购自上海吉凯基因化学有限公司；兔抗caspase-3、Bax、Bcl-2及β-actin一抗、羊抗兔IgG HRP标记的二抗均购自美国Affinity Biosciences公司；紫杉醇(Taxol)购自美国Bristol-Myers Squibb公司；Forma3111 CO₂恒温培养箱购自美国Thermo公司；IX71倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.3   细胞培养

将A549和BEAS-2B细胞均培养于含10%胎牛血清的培养基中，加入双抗后正常培养细胞。显微镜观察培养基中的液体，约2天更换1次培养液。待细胞长满培养瓶底部时加入PBS溶液消化细胞，收集处于对数生长期的细胞，以备后续实验所用。

1.4   肺腺癌紫杉醇耐药细胞系的建立

根据文献^[10]中逐步增量间歇作用法，建立A549细胞紫杉醇耐药株。取对数生长期A549细胞，培养细胞于含0.1 μg/ml的紫杉醇培养基中，48 h后弃掉培养基，用不含紫杉醇的培养基继续培养细胞。细胞传代后，将A549细胞培养于含0.2 μg/ml的紫杉醇培养基中培养48 h；根据以上方法逐渐增加紫杉醇浓度，直至A549细胞在5 μg/ml紫杉醇中稳定生长且传代时，停止诱导，将得到的A549细胞记为肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol。

1.5   细胞转染和分组

取1.4中A549/Taxol细胞，消化后接种于6孔板内，显微镜观察细胞的融合度。当融合度达80%以上时加入无血清培养基终止消化，根据转染试剂说明转染并分组细胞。

将A549/Taxol细胞分为pcDNA-NC组(转染pcDNA-NC空白载体)、pcDNA-SMAC组(转染pcDNA-SMAC载体)、siRNA-NC组(转染siRNA-NC空病毒载体)、siRNA-SMAC组(转染siRNA-SMAC慢病毒载体)。各组细胞均培养24 h。

1.6   qRT-PCR检测细胞中SMAC mRNA表达

取1.3和1.5步骤中的细胞，加入TRIzol裂解液，裂解细胞为细胞悬液，提取细胞悬液中总DNA，反转录为cDNA。将SMAC和内参GAPDH引物(见表 1)瞬时离心，加入去离子水，充分混匀后得到100 μmol/L的贮存液。扩增条件为：95℃ 10 min，95℃ 20 s，60℃ 34 s，共40个循环。用2^-ΔΔCT法分析SMAC的表达量。

表  1  引物序列表

Table  1  Primer sequence

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1.7   MTT法检测A549/Taxol细胞耐药性

取各组A549/Taxol细胞接种于96孔板中，培养贴壁，添加终浓度为5 μg/ml的紫杉醇继续培养48 h。每孔加入MTT溶液，于常规培养箱孵育4 h，弃孔板内MTT溶液，加入DMSO溶液，用酶标仪检测570 nm处各孔的吸光度值(OD)。计算各组细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药逆转倍数(FR)。

1.8   克隆实验检测细胞增殖

取各组A549/Taxol细胞，用胰蛋白酶消化细胞为单细胞悬液，于培养箱中培养细胞。梯度稀释悬液，接种悬液于恒温培养皿中，置入常规培养箱孵育2周，多聚甲醛固定后0.1%结晶紫染色。PBS洗涤3次并风干后，将培养皿倒置并覆盖在透明网格上，显微镜下(低倍率)计数大于10个细胞的克隆，计算集落形成率。

1.9   Transwell小室法检测细胞侵袭能力

制备A549/Taxol细胞悬液，离心细胞悬液，弃掉培养基后清洗，将含有0.1%的胎牛血清的DMEM培养基加入到细胞中，重悬细胞并将细胞密度调整为1.5×10⁴个/毫升。将Matrigel胶平铺于上室中，紫外线灯照射6 h消毒，将200 μl的细胞悬液加入到上室中；在下室中加入10%FBS的DMEM培养基，用37℃、5%CO₂的培养箱孵育Transwell小室24 h。将上室中残留的细胞和Matrigel胶用棉签轻轻擦掉，置于甲醛溶液中固定10 min，将0.1%的结晶紫加入到上室中孵育10 min，清洗小室，将小室的底部朝上放置，显微镜下观察，随机取5~10个清晰的视野分析细胞侵袭能力。

1.10   流式细胞术检测细胞凋亡能力

取各组A549/Taxol细胞接种于96孔板中，培养24 h，分别加入含有5 μg/ml阿霉素的无血清培养基培养48 h；洗涤细胞后加入500 μl Binding Buffer溶液重悬细胞，充分混匀，分别加入5 μl Annexin V-FITC和PI溶液并充分混匀，避光孵育培养板10 min，显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.11   蛋白质印迹检测A549/Taxol细胞中caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达

取各组A549/Taxol细胞接种于6孔培养板内，收集贴壁生长的细胞，胰酶消化得到细胞样品，RIPA裂解细胞，离心细胞后收集上清液于EP管中，取上清液为组织总蛋白，加1/5体积的6×Buffer缓冲液测定蛋白浓度。取100 μg总蛋白样品于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，采用5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入一抗caspase-3、Bcl-2、Bax抗体和内参β-actin抗体，置于4℃环境孵育过夜；PBS溶液洗膜后加入二抗，继续4℃环境孵育1 h，ECL曝光显影。

1.12   统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示。不同组间数据采用One-way ANOVA单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。

2   结果

2.1   各细胞中SMAC mRNA表达比较

A549细胞中SMAC mRNA表达较BEAS-2B细胞明显降低(P < 0.001)；pcDNA-SMAC组中SMAC mRNA表达显著高于pcDNA-NC组(P < 0.0001)；siRNA-SMAC组细胞中SMAC mRNA表达明显低于siRNA-NC组(P < 0.0001)，见图 1。

图  1  各组细胞SMAC mRNA表达比较

Figure  1  Comparison of SMAC mRNA expression in each group

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2.2   SMAC对A549/Taxol细胞耐药、增殖、凋亡和侵袭能力的影响

和pcDNA-NC组相比，pcDNA-SMAC组细胞IC₅₀、细胞克隆数和侵袭能力均显著降低，细胞凋亡能力明显增加，细胞耐药指数逆转倍数为2.51倍(均P < 0.0001)；和siRNA-NC组相比，siRNA-SMAC组细胞IC₅₀、细胞克隆数和细胞侵袭能力均显著升高，细胞凋亡能力明显降低(均P < 0.0001)，见图 2。

图  2  SMAC对A549/Taxol细胞耐药(A)、增殖(B)、凋亡(C)、侵袭(D)能力的影响

Figure  2  Effects of SMAC on drug resistance(A), proliferation(B), apoptosis(C), and invasion(D) of A549/Taxol cells

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2.3   SMAC对A549/Taxol细胞中caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

和pcDNA-NC组相比，pcDNA-SMAC组细胞中caspase-3和Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值均显著降低(P < 0.05)；siRNA-SMAC组细胞中caspase-3和Bax蛋白表达显著低于siRNA-NC组，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值明显高于siRNA-NC组(P < 0.05)，见图 3。

图  3  SMAC对A549/Taxol细胞中caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Figure  3  Effects of SMAC on the expression of caspase-3, Bcl-2, and Bax in A549/Taxol cells

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3   讨论

中国是肺癌的高发地区，目前临床上对NSCLC的常用化疗药物为紫杉醇等^[11-12]。文献显示^[13-14]，紫杉醇可终止细胞发生有丝分裂，进而对肿瘤的发生发展起调控作用。研究^[15-16]发现，紫杉醇在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的治疗中起重要作用，因临床疗效显著而被广泛使用。据统计^[17-18]，紫杉醇在一线化疗中的有效率为50%，但由于化疗耐药导致其在二、三线的化疗中有效率仅为20%。因此，化疗耐药是导致紫杉醇治疗肿瘤失败的主要原因。本研究通过制备紫杉醇耐药肺腺癌细胞，并给予细胞SMAC表达进行干扰，观察其对肺腺癌紫杉醇耐药细胞的耐药性和细胞活性的影响。

SMAC是一种新型促凋亡蛋白质，通过抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)从而诱导TNF受体介导的凋亡^[19-20]。有研究报道^[21]，SMAC mRNA的转录在肺癌进展时显著降低，说明SMAC是肺癌预后的新标志，并且在原发性肺癌的形成、进展及预后中可能起重要作用。国内学者研究发现^[22]，SMAC释放是顺铂诱导凋亡的必需物质，而且SMAC表达水平与化疗敏感度呈正相关。SMAC低表达可导致化疗耐药，而通过转染形成的高水平SMAC可使耐药的肿瘤细胞对顺铂介导的细胞毒性作用产生敏感度。有研究发现^[23]，SMAC可通过调节IAP家族成员抑制食管癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，可能成为食管鳞状细胞癌的有效治疗靶点。还有研究发现^[24]，SMAC可抑制结肠癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。但目前SMAC对肺癌的作用机制研究较少。本研究转染肺腺癌紫杉醇耐药细胞高表达和低表达SMAC，结果发现高表达SMAC可降低肺腺癌细胞紫杉醇耐药，调控细胞活性；低表达SMAC可增加肺腺癌细胞紫杉醇耐药并调控细胞活性。提示，SMAC基因敲除可降低对紫杉醇耐药的肺腺癌细胞株的药物敏感度，且促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡；反之，高表达SMAC可增加或改变原对紫杉醇耐药的肺腺癌细胞的药物敏感度，并有效调控细胞活性。曾辉等^[25]研究证实，高表达SMAC可增加肺癌细胞对顺铂的敏感性，并对肺癌细胞的生长有显著抑制作用。

研究发现^[26]，细胞中的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白间的相互平衡介导细胞凋亡，其中Bcl-2和Bax是研究较广泛的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，二者通常在正常的细胞中以二聚体的形式存在，可有效调控细胞的凋亡，且二者的比值介导细胞进入凋亡阶段的进程。文献显示^[27]，Bcl-2表达增加后可结合Bax形成异源二聚体，通过抑制Bax的活性并抑制细胞凋亡；Bax表达增加时可结合Bax形成同源二聚体，通过活化caspase-9酶切caspase-3酶原，且激活caspase-3表达对该剪切有促进作用，进而启动caspase级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。有研究发现^[28]，激活Bcl-2/Bax信号通路和诱导肝癌HepG2细胞凋亡可以发挥协同作用。研究发现^[29]，可通过上调caspase-3和Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达抑制子宫内膜癌细胞增殖、诱导凋亡。本研究结果显示，高表达SMAC对A549细胞中caspase-3和Bax蛋白表达起促进作用，对Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值起抑制作用；敲除SMAC则反之。陈康等^[30]研究证实，Smac基因可显著改善紫杉醇耐药肺腺癌细胞株的生物活性，并激活经典凋亡信号通路，其作用机制可能与调控caspase-3表达有关。

综上所述，高表达SMAC可增加或改变原对紫杉醇耐药的肺腺癌细胞的药物敏感度，抑制细胞生长和侵袭，促进细胞凋亡，可能和调控caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路相关，但肺腺癌紫杉醇耐药细胞药物敏感度的产生机制复杂，在今后的实验中将探寻更多的作用机制，为提高肺腺癌药物敏感度提供实验依据。