0   引言

胰腺癌（pancreatic cancer, PC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤，发病率逐年上升，5年生存率仅9%^[1-2]，其高死亡率与早期症状不典型且易转移有关，大多数患者确诊时即在晚期，缺乏有效的治疗手段。因此，寻找PC早诊的生物标志物及治疗靶点是近年研究的热点。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）长度超过200个核苷酸，最初被认为是“垃圾序列”，没有特定的生物学功能，但越来越多的研究证实lncRNA与肿瘤的发生发展密切相关^[3]。LINC00857是新近研究中发现的与多种肿瘤的增殖、转移、凋亡和预后相关的lncRNA^[4-10]，但在PC中鲜有研究。我们通过GEPIA数据库发现，LINC00857在PC组织中高表达，其表达水平越高，PC患者预后越差^[11]。然而LINC00857影响PC进展的机制尚不清楚。本研究拟检测LINC00857在胰腺细胞系中的表达水平，并通过慢病毒转染下调LINC00857的表达，探讨LINC00857对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其可能的机制。

1   材料与方法

1.1   实验材料

胰腺癌细胞株AsPC-1、PANC-1和胰腺正常上皮细胞HPNE购自上海中科院，胰腺癌细胞株CFPAC-1由甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室提供。胰蛋白酶和DMEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清和RPMI 1640培养基（BioInd，以色列）；TRIzol（Invitrogen，美国）；引物GAPDH和LINC00857（宝日生物，中国）；反转录和PCR扩增试剂盒（TaKaRa，日本）；PVDF膜、ECL发光液（Millipore，美国）；LV-LINC00857-RNAi慢病毒（上海吉凯生物，中国）；E-cadherin和N-cadherin抗体（Abcam，美国）；Vimentin（赛维尔，中国）；鼠抗人GAPDH（Proteintech，美国）；羊抗兔、鼠二抗（SAB，美国）；细胞周期试剂盒（索莱宝，中国）；细胞凋亡试剂盒（江苏碧云天，中国）；CCK-8试剂（日本同仁，日本）；Transwell小室（Corning，美国）。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

AsPC-1细胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，PANC-1、CFPAC-1和HPNE细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于恒温培养箱（37℃、5%CO₂）中培养。

1.2.2   慢病毒的设计和细胞转染

本实验中使用的LINC00857 shRNA慢病毒由上海吉凯基因公司构建，载体为GV112，元件顺序为hU6-MCS-CMV-puromycin，其中LINC00857-sh1序列为5'-CCGGCTCCTAGAATACCACGTTTATCTCGAGATAAACGTGGTATTCTAGGAGTTTTTG-3'，LINC00857-sh2序列为5'-CCGGAAGGTGGAGAAGAGTACCCAACTCGAGTTGGGTACTCTTCTCCACCTTTTTTTG-3'，空载体序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。根据慢病毒转染指南，六孔板中细胞汇合度在30%~40%时进行感染，MOI值为10。共计分为4组：Normal control组为未处理的正常对照组，Negative control组为转染空白载体的阴性对照组，LINC00857-sh1和LINC00857-sh2为实验组。转染16 h后换液，3天后用嘌呤霉素（2 µg/ml）筛选，隔天换液，筛选9天获得稳定转染细胞株。

1.2.3   RNA提取和qPCR法实验

待细胞融合度达80%~90%时，TRIzol提取细胞的RNA，检测浓度和纯度，随即将RNA反转录为cDNA，将cDNA原液5倍稀释后按10 μl反应体系进行PCR扩增。引物序列如下，LINC00857：F: 5'-CCCCTGCTTCATTGTTTCCC-3'，R: 5'-AGCTTGTCCTTCTTGGGTACT-3'；GAPDH：F: 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，R: 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。扩增参数：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1个循环。运用2^-ΔΔCt计算检测结果。

1.2.4   CCK-8法检测转染后PANC-1细胞增殖

消化处于对数生长期的细胞，取每孔100 µl细胞悬液（含2 000个细胞）接种于96孔板，每组重复5次，细胞贴壁后弃掉原液，CCK-8溶液和无血清的DMEM按1:10配置，每孔加100 µl配置液，恒温培养箱中培养2 h，酶标仪测450 nm波长处的吸光度（OD）值，每天检测1次，隔天换液，连续测5天。采用GraphPad软件绘制增殖曲线。

1.2.5   Transwell和划痕实验检测转染后PANC-1细胞的迁移能力

将对数生长期的细胞饥饿处理24 h，随即胰酶消化，取200 µl细胞无血清悬液（含6×l0⁴个细胞）接种于Transwell上室，600 µl（含30%胎牛血清）完全培养基加入下室，孵箱中培养48 h，随即用4%多聚甲醛固定、结晶紫避光染色，放置在浸没PBS的24孔板中，倒置显微镜（200倍）下多视野拍照。

六孔板中细胞融合度在90%左右时，在超净台中用10 μl枪头垂直划痕。轻柔洗去漂浮细胞，加入2 ml DMEM（不含血清），0 h和24 h于倒置显微镜（100倍）下拍照。利用Image J软件测细胞迁移前后的面积。划痕愈合率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.6   流式细胞仪检测转染后PANC-1细胞的细胞周期和凋亡

待细胞汇合度达70%~80%时，收集消化的各组细胞，取1 ml含1×10⁶个细胞的细胞悬液，离心后预冷PBS洗两遍，逐滴加入70%预冷的无水乙醇重悬细胞，随后置于4℃冰箱过夜，清洗后重悬于100 µl RNase A溶液，加400 µl碘化丙啶（PI）固定，上流式细胞仪检测细胞DNA含量。取胰酶（不含EDTA）消化的5~10万个细胞重悬于195 μl Annexin V-FITC结合液中，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，4℃避光静置20 min，加入300 μl结合液，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。使用ModFit软件分析细胞周期，FlowJo软件分析细胞凋亡情况。

1.2.7   Western blot实验检测转染后PANC-1细胞EMT相关蛋白的表达

提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，加入适量5×SDS蛋白上样缓冲液和强RIPA将待测蛋白样品定量至合适浓度，的100℃沸水中煮10 min使蛋白质变性。每孔加50 µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳（80 V 30 min，120 V 1.5 h，恒压）、湿转法转膜（200 mA，2~3 h, 恒流），5%BSA封闭1 h，TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，按分子量拆剪条带，放置于一抗（稀释比Vimentin 1:500，GAPDH、E-cadherin和N-cadherin均为1:1 000）中，4℃冰箱保存过夜；TBST清洗后在二抗（稀释比1:2000）中孵育1 h，ECL化学发光A、B液按1:1配置，曝光仪下显影并拍照。采用Image J软件核算蛋白条带灰度值。

1.3   统计学方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism 7.00统计软件对实验数据进行分析，定量资料用（x±s）表示，数据均进行正态分布检验，每个实验至少重复3次，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   LINC00857在胰腺细胞系中的表达及其在PANC-1细胞中的敲低情况

LINC00857在三种胰腺癌细胞系中的表达显著高于胰腺正常上皮细胞HPNE，差异有统计学意义（P < 0.01），其中以PANC-1细胞本底表达最高，故选择PANC-1细胞进行后续实验，见图 1A。对照组间LINC00857表达水平未见明显差异（P =0.5946），与对照组相比，实验组中LINC00857的表达水平均显著下调，差异有统计学意义（P < 0.0001），见图 1B。

图  1  LINC00857在胰腺细胞系中的表达情况（A）及其敲低效率的验证（B）

A: **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with HPNE cells; B: ****: P < 0.0001, compared with negative control group.

Figure  1  Expression levels of LINC00857 in pancreatic cell lines(A) and verification of its knockdown efficiency(B)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   CCK-8法检测细胞增殖结果

与Normal control组相比，Negative control组细胞OD值减小（24 h P=0.115，余P < 0.05）；与对照组相比，实验组细胞OD值均明显减小（均P < 0.0001）；实验组间OD值仅在48 h差异有统计学意义（P < 0.05）；表明下调LINC00857可抑制PANC-1细胞的增殖能力，见图 2。

图  2  LINC00857敲低对PANC-1细胞增殖能力的影响

*: P < 0.05, ****: P < 0.0001, compared with Negative control group.

Figure  2  Effect of LINC00857 knockdown on proliferation of PANC-1 cells

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   Transwell和划痕实验检测细胞迁移结果

与对照组相比，实验组穿过的细胞数目均明显减少（P < 0.0001），实验组和对照组间各自组间差异无统计学意义（P=0.7835和P=0.7279），见图 3A、3C。划痕实验也同样证实了敲低LINC00857可以显著抑制PANC-1细胞的迁移能力，见图 3B、3D。与Normal control组（78.54±40.25)%和Negative control组（78.06±1.263）%的划痕愈合率相比，LINC00857-sh1组（44.92±2.14）%和LINC00857-sh2组（42.75±1.425）%的划痕愈合率均显著下降（P < 0.0001），实验组和对照组间各自组间差异无统计学意义（P=0.9990和P=0.9226）。

图  3  Transwell（A、C）和划痕实验（B、D）检测LINC00857敲低对PANC-1细胞迁移能力的影响

****: P < 0.0001, compared with negative control group; A ×200, B ×100.

Figure  3  Effect of LINC00857 knockdown on migration of PANC-1 cells detected by Transwell(A, B) and wound-healing assay(B, D)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的结果

细胞周期结果显示，与Negative control组G₀/G₁期细胞的百分比（55.4±1.045）%相比，LINC00857-sh1组（64.91±1.185）%和LINC00857-sh2组（69.77±0.775）%显著上升（P=0.0058和P=0.0012），差异有统计学意义；实验组和对照组各自组间差异无统计学意义（P=0.9743和P=0.0599）。与Negative control组S期细胞的百分比（22.15±1.51）%相比，LINC00857-sh1组（14.24±0.02）%和LINC00857-sh2组（9.9±0.38）%明显减少（P=0.0493和P=0.0109），差异有统计学意义；实验组和对照组各自组间差异无统计学意义（P=0.6489和P=0.254），见图 4A、4C。说明敲低LINC00857后PANC-1细胞被阻滞在G₁期。

图  4  LINC00857敲低对PANC-1细胞周期（A、C）和凋亡（B、D）的影响

*: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with Negative control group.

Figure  4  Effect of LINC00857 knockdown on cell cycle(A, C) and apoptosis of PANC-1 cells(B, D)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

细胞凋亡结果所示，与Negative control组凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）比例（26.84±0.97）%相比，LINC00857-sh1组（41.45±0.55）%和LINC00857-sh2组（50.3±2.6）%明显增加（P=0.0178和P=0.0031），实验组和对照组各自组间差异无统计学意义（P=0.8005和P=0.0914），见图 4B、4D。说明敲低LINC00857后PANC-1细胞凋亡增加。

2.5   Western blot检测上皮间质转化相关蛋白表达的结果

对照组间EMT相关蛋白表达未见明显异常（均P > 0.05）；与Negative control组相比，实验组EMT相关的蛋白E-cadherin表达显著升高（P=0.0152和P=0.0196），N-cadherin表达显著下调（P=0.0001和P=0.0016），Vimentin表达显著降低（P=0.0208和P=0.0170），差异有统计学意义，见图 5。

图  5  LINC00857敲低对PANC-1细胞EMT相关蛋白表达的影响

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with Negative control group.

Figure  5  Effect of LINC00857 knockdown on expression of EMT-related proteins in PANC-1 cells

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3   讨论

近些年研究发现LncRNA与PC的恶性行为及治疗密切相关。如LncRNA DGCR5可诱导胰腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖^[12]；Wang等^[13]研究发现lncRNA H19不仅参与维持胰腺癌细胞干性，还与胰腺癌细胞的侵袭、迁移、EMT和化疗耐药性密切相关。纳米颗粒介导的致癌LncRNA DANCR已被证明有助于三阴性乳腺癌的治疗^[14]。LINC00857是一种新发现的LncRNA，位于人类染色体10q22.3的正链上，不能编码蛋白质^[4]。LINC00857在肺癌^[4-5]、胃癌^[6-7]、膀胱癌^[8]、肝癌^[9]、食管癌^[10]等癌组织或细胞中高表达，通过不同机制促进肿瘤的恶性进展。已有研究^[15]通过生物信息学分析发现LINC00857在PC组织中高表达，与PC预后呈负相关，提示LINC00857可能作为促癌基因参与PC的恶性进展。然而，LINC00857在胰腺癌细胞中的表达和作用机制尚无报道。

本研究发现，LINC00857在胰腺癌细胞系中高表达。下调LINC00857后，细胞增殖能力明显减弱，说明LINC00857在PC中是一种促癌因素。细胞周期和凋亡实验发现实验组较对照组细胞凋亡率明显增加，G₀/G₁期比例增加，S期比例下降，细胞被阻滞在G₁期。Wang等^[4]和Pang等^[7]研究发现，LINC00857下调后，细胞周期信号通路失活，细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白E1（cyclin E1）表达减少，细胞被阻滞在G₁期，细胞增殖受到抑制；LINC00857表达缺失后肺癌和食管癌细胞凋亡比例增加，细胞增殖被抑制^{[5, 10]}。由此可见，G₁期阻滞或诱导凋亡可能是LINC00857下调抑制肿瘤生长的机制。本研究Transwell和划痕实验同时证实，下调LINC00857可抑制PANC-1细胞的迁移能力；为了探究其原由，我们检测了EMT相关蛋白的表达，与对照组相比，实验组的E-cadherin表达明显上升，N-cadherin和Vimentin表达显著下降，EMT过程被抑制。这与Xia等^[9]在肝癌中的研究一致。肿瘤早期转移与细胞的EMT过程紧密相关，EMT可加速肿瘤的侵袭和迁移^[16]，这种癌细胞的表型转换是胰腺癌细胞恶性生长所必需的^[17]。LncRNA SNHG12可通过EMT增加胰腺癌细胞的恶性行为^[18]。因此，EMT可能是实验组和对照组迁移能力差异的原因。

综上所述，LINC00857在胰腺癌细胞系中高表达，下调LINC00857可抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力，促进细胞的凋亡，其机制可能与G₁期阻滞和EMT信号通路有关。LINC00857对PC的发生发展起促进作用，可能成为PC治疗的新靶点，但LINC00857在PC中的具体作用机制仍需进一步探究。