0   引言

目前已发现EGFR T790M突变是非小细胞肺癌（NSCLC）应用EGFR-TKIs药物产生继发性耐药的最常见原因^[1]。T790M突变后对NSCLC的治疗有重要影响。本文分析了NSCLC患者T790M突变与一、二、三代TKIs药物之间的关系，评估了与原发性T790M突变相关的临床因素，同时分析了第三代EGFR-TKI药物的新型继发性耐药。

1   T790M突变与非小细胞肺癌

EGFR基因突变是NSCLC东亚人群中最常见的驱动基因突变，其发生率为30%~40%^[2]。EGFR是穿透细胞膜的受体蛋白，激酶结构域由N和C叶片以及两个叶片之间的三磷酸腺苷ATP结合裂隙组成。在配体与受体结合后，形成不对称二聚体，并将ATP的磷酸转移至调节结构域的酪氨酸残基，见图 1。各种蛋白质与这种磷酸化酪氨酸相结合，信号通过大鼠肉瘤（RAS）下游传递-快速加速纤维肉瘤（RAF）-活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB），转导也称为AKT途径，从而调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡，与肿瘤的形成和恶化密切相关，见图 2。EGFR-TKIs通过激酶结构域的裂解竞争性地抑制ATP。既往多项研究表明第一代或第二代EGFR-TKIs在EGFR突变型晚期NSCLC患者中疗效优于传统以铂类药物为基础的化疗^{[1, 3]}，但是大多数EGFR突变的患者在接受EGFR-TKIs治疗9~14月后会对EGFR-TKIs产生抗性^{[2, 4]}。EGFR基因20外显子第790位氨基酸由甲硫氨酸代替苏氨酸的这种变化简称为T790M突变，约占继发性耐药的60%^[2]。选择性抑制EGFR敏感突变和EGFR T790M耐药突变的第三代EGFR-TKIs应运而生，然而也出现了新的耐药机制。

图  1  EGFR激活模式图

Figure  1  Activation pattern of epidermal growth factor receptor

A: structure of the epidermal growth factor receptor (EGFR); B: activation of the EGFR.

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图  2  EGFR下游信号转导图

Figure  2  Downstream signal transduction of epidermal growth factor receptor

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2   EGFR-TKIs与T790M突变

2.1   第一代TKIs与T790M突变

第一代EGFR-TKIs的继发性耐药机制有：T790M突变约占57%；HER2扩增约占6%；MET扩增约占3%；EMT约占1%；SCLC转化约占3%；T790M突变合并EGFR扩增约占1%；多基因突变约占10%，其它未知突变约占19%。从组织学和生物学上对获得性耐药的组织样本进行的回顾分析表明，在某些病例中，这些机制可能同时存在，而不是相互排斥的^[5]。

T790M是第一个报道的继发性耐药基因。它通过改变ATP结合口袋的晶体结构，在结构上抑制第一代EGFR-TKIs与ATP结合位点的结合。因此，发生T790M突变后TKI药物不能抑制下游信号的转导，癌细胞不受控制，见图 3^{[1, 6]}。有研究认为，在用EGFR-TKIs治疗之前，少数具有继发性T790M突变和活性EGFR突变的癌细胞可能已经隐性存在，并在用TKI治疗期间逐渐成为显性。然而，最近的研究表明，T790M阳性细胞也是通过遗传进化从最初的T790M阴性细胞中发展而来的^[6]。

图  3  EGFR获得性耐药主要机制图

Figure  3  Main mechanism of EGFR-acquired resistance

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2.2   第二代TKIs与T790M突变

为克服T790M突变引起的继发性耐药，第二代EGFR-TKI应运而生。它的研发思路是进一步促进药物与ErbB受体网络形成共价结合，从而不可逆地、完全中断信号转导，带来持续且广谱的抗癌活性^[7]。然而，虽然第二代EGFR-TKIs对T790M有影响，但是它克服T790M活性的浓度在人类中是不可实现的。其半数最大抑制浓度（IC₅₀）比EGFR活化突变观察到的高30~100倍^[8]。对LUX-Lung 3及LUX-Lung 6的一项Ⅲ期随机临床试验显示，与化疗相比，阿法替尼一线治疗可使携带普通EGFR突变（Del19/L858R）的晚期NSCLC患者的OS提高3月（中位OS 27.3月vs. 4.3月，P=0.037）^[9]。此外，LUX-Lung 7比较阿法替尼和吉非替尼治疗EGFR突变的NSCLC患者的随机Ⅱb期试验，显示出阿法替尼对无进展生存期（PFS）的优势（11.0 vs. 10.9月，P=0.0073）^[10]。这些结果表明，与第一代EGFR-TKIs相比，第二代EGFR-TKIs延迟了T790M的表达。然而，用阿法替尼治疗的患者中仍有36.4%~47.6%的患者检测到了T790M突变^[11]。阿法替尼的应用在使用第一代TKIs治疗后产生T790M突变的晚期NSCLC患者中受到限制。

2.3   第三代TKIs药物与T790M突变

第三代EGFR-TKIs包括奥希替尼、Rociletinib、Olnutinib等^[12]，其中奥希替尼是以T790M为靶点的不可逆的EGFR-TKI。它结构中含有丙烯酰胺基，能够与EGFR基因的ATP结合位点中C797结合，形成不可逆的共价键，从而抑制癌细胞的增殖。通过阻断突变EGFR同源二聚化或诱导EGFR突变细胞降解等途径，从而阻断其下游信号传递^[5]，奥希替尼对EGFR突变的细胞系及EGFR T790M突变的细胞系均有效。AURA3试验则进一步证实了奥希替尼对患有EGFR T790M突变的NSCLC患者的疗效。试验显示，对于一、二代TKI治疗进展产生T790M突变的患者，奥希替尼优于铂剂联合培美曲塞治疗（PFS: 10.1月vs. 4.4月，P < 0.001）。此外，对于存在中枢神经系统转移的患者，接受奥希替尼治疗的中位PFS也明显长于接受化疗的（8.5月vs. 4.2月，HR=0.32）^[4-5]。在FLAURA试验中，一项Ⅲ期临床试验证实了对于未治疗的EGFR阳性NSCLC患者，奥希替尼与一、二代TKIs相比，显著延长了患者的PFS及OS（PFS: 18.9月vs. 10.2月，P < 0.001；OS: 38.6月vs. 31.8月，P < 0.001）^[13-14]。

EGFR-TKIs常见的不良反应包括皮疹、腹泻、甲沟炎、口腔黏膜炎、间质性肺疾病、药物性肝损伤等。在LUX-Lung 7及ARCHER研究中二代TKI的不良反应均高于一代，一代TKI引起的三级以上不良事件（adverse event, AE）以肝酶升高及皮肤相关不良反应居多，而二代TKI引起的三级以上AE以腹泻及皮肤相关不良反应居多。其原因可能由于二代TKI推荐剂量接近其剂量限制性毒性，故相关毒性也比一代药物明显。在临床试验中，奥希替尼的不良反应发生率明显低于第一、二代EGFR-TKI。最常见的不良反应为腹泻（42%）、皮疹（41%）、皮肤干燥（31%）和神经毒性（25%）。4.4%的患者因为耐受性原因，减少给药剂量或终止治疗，主要原因是Q/T间期延长（2.2%）和嗜中性白血球减少（1.9%）；严重不良反应的发生率为2%，主要为肺炎和肺栓塞^[15]。

3   TKI应用前的T790M突变

3.1   原发性T790M突变的临床特征

T790M突变多继发于一二代TKIs药物治疗后，但在少数情况下，EGFR T790M突变在应用TKIs治疗之前已被发现。原发性EGFR T790M的突变频率与所用测定方法的敏感度及其识别肿瘤内微小克隆的能力有关。有研究提出，暴露于EGFR TKI之前的EGFR突变肿瘤含有一小部分EGFR T790M亚克隆^[16]。文献中原发性EGFR T790M突变频率差异很大。从在肺癌和EGFR突变型肺癌中各占不足1%，到在肺癌和EGFR突变型肺癌中分别占25%和79%。报告的突变频率范围很大与检测方法和测试的人群有关。使用敏感度较低的Sanger测序测得原发性EGFR T790M突变的发生率为0.4%~3%，且仅与敏感EGFR突变一起报道^[16]。而使用敏感度更高的方法时，原发性EGFR T790M突变的发生率则更高，占所有肺腺癌的4%~25%^[17]。敏感度高的检测方法包括基于质谱的突变检测和几种基于突变体富集的PCR测序方法（包括限制酶消化、基于锁定核酸的PCR和Scorpion Amplification难治性突变系统技术）^[15]。菌落杂交法和TaqMan分析在人群中可检测出原发性EGFR T790M突变比例最高。更敏感的测定方法，可以检测含有EGFR T790M的小克隆，但也存在假阳性结果的可能性。原发性EGFR T790M突变的肺癌患者常常具有同时致敏的EGFR突变，比如21外显子L858R点突变或19外显子缺失突变。但当应用更敏感的分子检测时，也发现了EGFR T790M突变而没有共同致敏的EGFR突变的情况。

3.2   原发性T790M突变TKI药物疗效及预后

具有原发性EGFR T790M突变的肺癌患者的临床特征与只有致敏EGFR突变的患者相似。但是，原发性EGFR T790M突变也与对厄洛替尼等一、二代TKI药物的低反应率、PFS短相关^[17]，同时原发性EGFR T790M突变患者的总生存与EGFR野生型患者总生存相似。不同检测方法检测到的基线EGFR T790M突变对TKI药物应答率也不同。当通过常规分子检测鉴定时，EGFR T790M的存在预示对EGFR TKI治疗反应欠佳。通过SARMS等更敏感检测方法检测到EGFR T790M的患者对厄洛替尼的反应不如仅存在致敏EGFR突变肿瘤的患者敏感，但优于对标准细胞毒性化学药物的反应。Yu等^[16]综述了应用厄洛替尼治疗EGFR T790M突变肿瘤患者的PFS为8月，而无T790M突变的EGFR突变肿瘤患者的PFS为17月（P < 0.001）。与通过标准测序检测到的EGFR T790M突变不同，使用敏感测定突变丰度较低的原发性EGFR T790M突变的患者也可能对EGFR TKI存在响应，但似乎这种响应持续时间较短。原发性EGFR T790M突变肿瘤患者的中位总生存期较短，仅为16月，与EGFR野生型肿瘤患者相似，而仅仅是致敏EGFR突变肿瘤患者生存时间的一半^[16]。此外，还有研究表明在应用三代TKI药物奥希替尼治疗时，原发性T790M组与获得性T790M组相比，中位PFS显著延长（17.0月vs. 10.0月），而获得性T790M突变患者的中位OS更长（50.4月vs. 29.9月，P=0.016）^[18]。

4   第三代TKI药物继发性耐药

第三代TKI药物，对于EGFR阳性及EGFR T790M突变患者表现出优异的临床效果，但耐药性的发展也是不可避免的。其耐药机制可以分为：依赖EGFR通路的，如：新发突变、T790M减少或消失和EGFR基因扩增；不依赖EGFR通路的，如：旁路途径的激活和细胞表型的转变等。

4.1   新发突变

EGFR-C797S突变是第三代TKI耐药最常见的原因，约在第三代EGFR-TKI药物应用1年内出现^[1]。C797S存在于ATP结合域内，与EGFR-TKI不可逆地结合。因此，EGFR的外显子20中C797S的点突变即EGFR 20号外显子797位点上的丝氨酸取代了半胱氨酸的错义突变，影响了奥希替尼在ATP结合域内形成共价键的过程，从而失去抑制EGFR激活的效果，产生继发耐药^[19]。研究发现，T790M和C797S在等位基因上的定位有助于确定C797S的治疗策略。如果EGFR C797S突变与T790M突变位于同一染色体上，被称为顺式构型，约占C797S突变的85%，这种突变对目前所有EGFR-TKIs都具有耐药性。大约10%的患者为C797S和T790M成反式构型即位于不同染色体上，则耐药细胞可能对第一代和第三代EGFR-TKIs的联合治疗敏感^[20]。此外少数患者仅有C797S突变并未合并T790M突变，C797S突变在T790M野生型细胞中发生，导致对第三代TKIs耐药，而对第一代TKIs敏感。此外有临床试验表明，对于EGFR、T790M、C797S三重突变的患者，强效间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂，即brigatinib，通过诱导EGFR表达的降解，与抗EGFR抗体的组合显著降低了针对三重突变EGFR的IC₅₀，导致三重突变体EGFR的肿瘤缩小，这可能是未来治疗EGFR、T790M、C797S三重突变患者的一种选择^[21]。

除了C797S外，研究者们还陆续发现了新的耐药突变，如L792X突变、G796S突变、L718Q突变和20外显子插入突变等。细胞毒性药物是L718Q突变患者的治疗选择之一。外显子20插入通过在EGFR的N-叶上添加残基来抑制EGFR-TKI与其结合位点的结合^[22]。耐药突变的多样性，提示T790M突变患者耐药后的肿瘤呈异质性，所以在靶向治疗的各阶段进行基因检测是很有必要的。

4.2   T790M突变减少或消失和EGFR基因扩增

T790M突变减少或消失也是导致三代TKI药物继发性耐药的原因之一。T790M的突变负荷可以预测第三代TKIs的疗效，突变负荷越大，效果越好。相反，T790M消失的患者奥希替尼治疗的效果差^[22]。第三代TKIs的选择性压力可能是T790M突变负荷减少或消失的原因。EGFR基因扩增更多见于三代TKI CO-1686治疗的患者，可以合并存在T790M突变。据报道CO-1686耐药患者中有9%出现EGFR基因拷贝数的变化^[23]。EGFR基因扩增可能会导致TKIs类药物浓度相对不足，导致耐药。

4.3   旁路途径的激活

4.3.1   MET基因扩增

旁路途径激活中最常见的替代途径是MET基因扩增，占获得性EGFR-TKIs耐药病例的5%~10%。MET基因扩增诱导MET蛋白的自身磷酸化并与ERBB3结合，ERBB3激活PI3K/AKT途径，导致对EGFR-TKIs耐药^[24]。Planchard等^[25]最早发现奥希替尼耐药的患者中存在MET基因扩增，同时伴有T790M突变的消失。MET抑制剂克唑替尼单用或者与三代TKIs联和应用可以很好地抑制对三代TKIs耐药的肿瘤细胞的生长。在奥希替尼耐药的患者中可以检测到MET基因扩增，克唑替尼单药治疗有效^[22]。

4.3.2   HER2基因扩增

HER2是ERBB家族的成员，但HER2缺乏其在二聚化中起关键作用的特异性配体，不能形成同二聚体。因此，HER2仅作为单体或异二聚体与其他配体结合的家族成员，如：与EGFR共同存在^[26]。HER2和EGFR间接激活PI3K，并且HER2基因的扩增与获得性与EGFR-TKIs耐药有关，在产生耐药的EGFR突变的NSCLC患者中的发生率为12%。通过对奥希替尼耐药患者进行基因检测分析发现了HER2基因的扩增^[25]。在对CO-1686耐药的患者中也观察到了HER2的扩增^[23]。有体外研究表明^[27]，通过应用T-DM1，一种曲妥珠单抗的药物偶联物，可以延缓或克服奥希替尼的耐药。

4.3.3   KRAS突变

临床前研究显示，奥西替尼继发性耐药与RAS信号通路的激活有关，包括NRAS基因E63K突变，野生型NRAS及KRAS扩增^[22]。既往研究认为，KRAS突变和EGFR突变具有排他性，但近年研究发现，在 < 2%的NSCLC患者中发现KRAS和EGFR基因也是可以共存的^[1]。通过对循环肿瘤进行DNA分析显示，EGFR突变的NSCLC患者在用第三代EGFR TKI治疗后也可以获得KRAS的激活突变，部分KRAS突变可与PIK3CA和MET等途径共同存在^[23]。RAS抑制剂可通过下调赖氨酰氧化酶来抑制结直肠癌细胞的转移，然而，RAS抑制剂对EGFR获得性耐药的疗效目前尚不清楚。

4.3.4   PIK3CA基因突变

PIK3CA是肺腺癌的驱动基因之一，它通过PI3K/AKT/mTOR途径激活，常与HER2、MET及EGFR等其他突变合并存在，PIK3CA突变的肺癌患者中位生存时间更短^[22]。Chabon等^[23]报道CO-1686耐药患者PIK3CA基因突变的发生率约12%。在奥希替尼治疗的患者中也有PIK3CA基因突变的报道。

4.3.5   其他旁路途径的激活

胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R）通路、同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tension homology deleted on chromosometen, PTEN）基因缺失、成纤维细胞生长因子2-成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor 2-fibroblast growth factor receptor 1, FGF2-FGFR1）扩增等都可能导致奥希替尼继发性耐药^[22]。

4.4   细胞表型的转变

在第一代及第三代EGFR-TKIs治疗后都可能出现NSCLC的SCLC转化，在第一代EGFR-TKI的耐药机制中占3%~10%，在第三代EGFR-TKI的耐药机制中占1%。研究发现，伴有RB1、TP53和PIK3CA突变的NSCLC更容易发生SCLC转化，与第一代TKIs耐药机制相似，第三代TKIs出现SCLC转化耐药时，肿瘤仍保持典型的EGFR驱动突变，这提示SCLC由EGFR突变克隆进化而来，但T790M突变大部分消失^[28]。发生SCLC转化而产生耐药的患者对铂剂联合依托泊苷反应有效，但对检查点抑制剂无反应，提示我们重复基因检测的必要性。

4.5   其他

在奥希替尼耐药患者的胸水中，检测到BRAF V600E基因突变，且BRAF V600E抑制剂可以抑制肿瘤细胞生长，联合应用奥希替尼效果更好^[29]。Bcl-2样蛋白11（BIM）是凋亡的关键介质。低表达水平的BIM的EGFR突变的肺癌细胞对EGFR-TKI治疗表现出低敏感度。BIM蛋白缺失多态性可在12%的东亚人中检测到，被认为参与了第三代TKIs的耐药^[19]。此外还有细胞周期基因改变、致癌基因融合、氧化供能途径的改变等机制^[12]。

5   展望

本文回顾分析了原发性及继发性T790M突变与EGFR-TKIs的关系，及第三代TKIS治疗T790M突变后发生的新的耐药机制。根据不同的耐药机制制定适当的治疗策略是必要的。在NSCLC治疗中多次准确地基因检测，寻找可能的突变及耐药机制，为临床下一步治疗提供线索至关重要。