0   引言

大量研究表明，胶质瘤干细胞（glioma stem cells, GSCs）的生物学特性类似于神经干细胞，体内培养GSCs可产生与来源组织表型相同的肿瘤组织^[1]，作为胶质瘤的重要起源细胞，GSCs的生存微环境对肿瘤的发生发展影响巨大。GSCs微环境主要由胶质瘤细胞、各种间质细胞、微血管、组织液、浸润细胞和细胞因子构成^[2]，可分为血管微环境、缺氧微环境、免疫微环境三类，主要功能为介导细胞和物质之间的反应，提供GSCs稳定存在的基础。GSCs在利用微环境的同时，还能够主动调节、重塑微环境，因此微环境始终处于动态变化之中。有学者认为这种变化的微环境可能导致了干细胞的恶性转化，促进了肿瘤的生长迁移^[3]。微环境作为治疗恶性胶质瘤的一个靶点，具有十分重大的探究意义。

1   GSCs血管微环境

胶质瘤的生长需要周围血管为其提供充足的营养物质，微血管增生是恶性胶质瘤的一个重要特征^[4]，随着胶质瘤恶性程度的增高，其周围血管分布密度逐渐增大。相关免疫荧光实验证明，GSCs聚集分布于血管周围，血管密度影响着其数量多少^[5]。

1.1   血管微环境作用机制

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是由GSCs高水平分泌、直接作用于内皮细胞的一种促进新血管生成的生长因子^[6]。VEGF与血管内皮生长因子受体2（VEGF receptor 2, VEGFR2）特异性结合后，促进内皮细胞分裂增殖，并改变其渗透性，进而推动内皮细胞迁移并加速诱导新血管生成。神经纤毛蛋白1（neuropilin-1, NRP1）是VEGF的辅助受体，血管增生依赖于NRP1的存在。NRP1可与VEGFR2共表达增强VEGFR2同VEGF的结合力^[7]，同时形成的复合物可提高VEGFR2的活性，进一步促进血管生成，最终在GSCs周围形成丰富的血管聚集。内皮前体细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）易受GSCs的趋化作用聚集于GSCs血管微环境中，并被加速分化为内皮细胞从而加快微血管形成。部分GSCs具有分化为内皮细胞的潜能，相关研究表明约60%内皮细胞来源于GSCs，一旦分化为内皮细胞便可直接促进新血管生成^[8]。

内皮细胞是GSCs血管微环境中的重要组成部分，由它分泌的可溶性因子能够维持GSCs的未分化状态、持续自我更新。实验证明，将GSCs和内皮细胞共同培养于Transwell室中，两周后可观察到实验组的肿瘤球大小是对照组的五倍，进一步研究发现实验组CD133⁺、nestin⁺ GSCs自我更新能力明显强于对照组。通过三维器官外植系统研究胶质瘤时发现，内皮细胞的减少直接导致干细胞成球能力下降，其最终成球率不足50%^[9]。而通过3 Gy射线分别照射单培养的内皮细胞和与胶质瘤细胞共培养的内皮细胞实验，发现前者的凋亡率更高。以上研究均表明血管微环境中的内皮细胞有助于维持GSCs的干细胞特性和促进肿瘤形成。目前普遍认为，血管微环境主要是通过作用β-链蛋白通路、Notch通路和细胞重编程等通路维持GSCs的干性和放化疗耐受性。

1.2   血管微环境与治疗靶点

血管微环境为维持GSCs干细胞特性提供了丰富的物质基础，并能保护其免受外源环境影响，因此胶质瘤具有较强的抗放疗化疗性，其中内皮细胞在干细胞与肿瘤细胞的抗辐射损害中发挥着核心作用。在裸鼠实体瘤移植实验中，内皮细胞型小鼠形成的肿瘤与野生型小鼠相比更不易受到辐射损伤^[10]。另有研究证实血管微环境可以通过Akt、PKB通道使GSCs对化疗、放疗产生耐受。目前，通过抗血管生成、靶向血管微环境的疗法被认为是一种比较有前途的治疗方法，减少血管生成可直接阻断血液营养物质向肿瘤组织的输送。哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin, mTOR）是由内皮细胞介导的重要信号通路，包括药物分子雷帕霉素、PP242和P1103在内的抑制剂均能阻断GSCs分泌VEGF、抑制血管生成。基质生长因子1（stromal derived factor-1, SDF-1）拮抗剂AMD3100能明显减少肿瘤血管生成。VEGF特异性单克隆抗体贝伐单抗能阻断VEGF与VEGFR2的结合，从而抑制血管生成^[11]。然而，有学者指出VEGF拮抗不足以抑制新的GSCs血管微环境形成，因为它似乎会增加FGF1、FGF2和CXCL12等促血管生长因子的表达^[12-13]和补充骨髓衍生细胞促进血管生成^[14]。近年来不断有实验证明，抗血管药物的使用在影响肿瘤血管微环境的同时可能会造成正常血管退化，加重缺氧而诱导肿瘤恶性转化，甚至加速肿瘤的局部侵袭和远端转移，这也是后期研究需要解决的问题。

2   GSCs缺氧微环境

缺氧是恶性胶质瘤的一个重要标志^[15]。缺氧微环境是机体或肿瘤组织在缺血等病理因素影响下出现于局部或整体的一种内环境状态，在正常脑组织和肿瘤组织中均十分常见^[16]。研究显示，健康脑组织的生理氧浓度范围为12.5%至2.5%之间（PO₂=200~100 mmHg），而大多数胶质瘤都呈轻度至中度/重度缺氧状态，氧浓度介于2.5%和0.5%之间（PO₂=20~4 mmHg）为轻度缺氧，介于0.5%和0.1%之间（PO₂=4~0.75 mmHg）则为中度/重度缺氧^[17]。

2.1   缺氧微环境作用机制

胶质瘤细胞在发生发展过程中处于高代谢状态，为了满足其生长要求，周围血管需要向其提供大量蛋白质、氧气及其他营养物质^[18]。肿瘤大小在1~2 mm³之间时，通过弥散作用即可从血液中获取足够的氧气和营养物质；而当肿瘤块超过1~2 mm³时，正常的组织供给无法再满足生长所需，导致缺氧区形成，同时激活由缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）介导的缺氧分子反应^[19]，在肿瘤组织周围形成新血管。HIF是由HIFα亚单位和HIFβ亚单位构成的二聚体，HIFα对氧敏感，HIFβ对氧不敏感。氧含量正常时，氧依赖性脯氨酰基羟化酶域蛋白质（prolyl hydroxylase domain proteins, PHDs）将HIFα蛋白酶体降解致其羟基化。缺氧状态下PHDs活力下降，对HIFα的降解作用被抑制使HIFα得以保持稳定，稳定的HIFα主动与HIFβ结合形成二聚体，于缺氧诱导基因启动因子中的低氧效应元件上发挥作用，提高VEGF的表达，增加内皮细胞的迁移最终诱导新血管形成。然而，由于缺少正确的引导因子，这些新生血管常常出现盲端、闭塞、破损、渗漏等异常情况，限制了氧气输送^[20]，无法保证肿瘤生长所需要的氧气供应，因此进一步加重了组织急性缺氧^[21]，而GSCs也一直处于相对缺氧的环境中。

相关研究表明，缺氧微环境有助于GSCs维持未分化状态和干细胞特性。体外培养GSCs发现，氧含量浓度为1%时，GSCs的分化受到明显抑制，低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factors-1α, HIF-1α）和HIF-2α这两种介导缺氧反应的主要信号分子表达显著上调，继而通过调节p53和Notch等重要细胞内通路活性，使GSCs停止分化，促进CD133⁺、CD184⁺、CD44⁺ GSCs的自我更新和增殖，延缓肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤异质性和侵袭性^[22-23]。研究发现，将分选后的胶质瘤细胞于缺氧条件下培养，SOX2、OCT4、LIN28等胚胎干细胞样标记蛋白出现高表达^[24]，说明缺氧增强GSCs干性。近年来，研究人员还发现了缺氧可诱导胶质瘤细胞逆分化为GSCs的证据，进一步说明了缺氧对GSCs的维护作用。

2.2   缺氧微环境与治疗靶点

缺氧条件下，细胞自由基更易与H⁺结合而被还原，使DNA损伤水平降低，这是肿瘤自我修复和抗放疗的机制之一^[25]，肿瘤组织氧含量也因此成为一个治疗靶点，相关高压氧治疗作为纠正缺氧微环境的唯一有效物理手段备受关注。然而高压氧治疗的有效性和安全性还存在较大争议，单独使用时可能会促进肿瘤生长，联合放化疗可提高肿瘤对药物的敏感度，但也会加重某些药物对机体的不良反应。在参与介导缺氧分子反应的HIF家族中，HIF-1α和HIF-2α的表达非常重要。HIF-1α高表达广泛存在胶质瘤细胞，而HIF-2α高表达具有特异性，主要存在于GSCs^[26]。HIF-1α参与GSCs自我更新，缺氧下过表达可以增强胶质瘤细胞糖酵解，增加细胞中乳酸含量并延缓肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞的辐射抗性^[25]。HIF-2α在缺氧时表达上调，造成c-Myc、OCT4和SOX2等干细胞相关标志物表达上升，促进干细胞VEGF的表达、提高肿瘤细胞体外成球能力和抗放化疗性，而HIF-2α表达量的多少更与胶质瘤预后紧密相关。因此，针对缺氧微环境的治疗靶点主要定位在HIF家族，其中HIF-1α和HIF-2α的地位尤为重要。通过影响HIF介导缺氧分子反应，缺氧促进GSCs自我更新来加重胶质瘤恶性进展，以此促进肿瘤的发生发展及抗放化疗的过程将受到遏制，最终可实现对胶质瘤的治疗。目前，针对HIF靶点治疗的药物在数量上取得较大突破，但可利用于临床早期的化合物进展不大，都还只停留在体外动物实验阶段。

3   GSCs免疫微环境

大部分肿瘤都具有免疫耐受的特点，有证据显示GSCs在胶质瘤免疫耐受中起着至关重要的作用。在GSCs周围存在一个由小胶质细胞、巨噬细胞、调节性T细胞等多种细胞成分构成的免疫微环境，通过异常免疫细胞活化、分泌免疫抑制因子、细胞免疫下调等方式，免疫微环境在保护肿瘤细胞免受免疫细胞攻击的同时，还能促进肿瘤生长侵袭。

3.1   免疫微环境作用机制

GSCs与免疫微环境中的免疫细胞始终处于相互调节中。GSCs细胞表面表达主要组织相容复合物l（major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC-Ⅰ)、一致性共刺激分子B7-H1等，但不表达MHC-Ⅱ、CIMO和CD80等物质，使GSCs免疫原性发生改变，导致免疫系统忽视对GSCs的监视作用，并诱导效应T细胞凋亡^[27]。而且GSCs细胞膜表面还存在微绒毛，这种微绒毛不仅可以缓冲肿瘤所受的物理损伤，还可以诱导细胞释放细胞毒效应分子继而抵御免疫细胞的攻击^[28]。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是GSCs免疫微环境中最主要的炎性浸润细胞，包括小胶质细胞、巨噬细胞在内的TAMs数量约占免疫细胞总数一半^[29]，被认为是肿瘤生长侵袭的重要诱导细胞。GSCs能够分泌趋化因子吸引TAMs在CD133⁺GSCs周围主动聚集，还能分泌细胞因子促进TAMs增殖。TAMs一方面通过吞噬因缺氧而生存期缩短的肿瘤细胞促进肿瘤生长^[30]，另一方面还能分泌IL-10、TGF-β、B7-H1、FasL等免疫抑制因子^[31]，抑制免疫反应使肿瘤细胞逃避免疫系统的作用，进而促进肿瘤生长。研究发现，小胶质细胞在参与胶质瘤免疫反应过程中，还能够通过释放可溶性因子激活Pyk2等促进肿瘤迁移^[32]。

调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）是机体最重要的免疫抑制细胞，它的浸润程度随着肿瘤级别升高而增大。肿瘤细胞和TAMs可分泌CCL22等趋化因子，吸引Treg向瘤巢迁移^[33]；IL-2作为Treg增殖和维持稳态的重要因素，可促进Treg优先扩增；TGF-β等能诱导Treg重新分化^[34]。通过以上作用机制，Treg丰富募集于肿瘤组织。CD4⁺、CD25⁺、Foxp3⁺ Treg分泌的IL -10、TGF-β等免疫负性细胞因子可帮助肿瘤逃避免疫监视^[35]，还能抑制CD8⁺T细胞在肿瘤周围聚集^[36]。Treg表达的穿孔素和颗粒酶能诱导细胞溶解，并竞争性消耗IL-2、诱导释放腺苷而干扰效应T细胞代谢来实现免疫逃逸。Treg表面的CTLA-4能与树突状细胞（dendritic cells, DCs）表面的CD80、CD86结合，诱导DCs过表达IDO等抑制性分子从而促使效应T细胞失活^[37-38]。实验中GSCs培养上清液可增加CD4⁺Treg比例，提示GSCs对Treg的调节作用。另外缺氧环境下，GSCs的STAT3通路被激活，其下游产物HIF-1α和VEGF表达增多，使Treg表达大幅上调，显著增强免疫抑制效果^[39]。

3.2   免疫微环境与治疗靶点

实验证明，通过作用B7-H1、MHC-I、TGF-β、CCL2、PD-L1、Galectin-3和STAT3等信号分子都可以促进Treg增殖，抑制效应T细胞参与免疫反应，而使肿瘤免疫耐受^[40]，因此以上通路均可作为免疫微环境中的治疗靶点。近年来研究较多的针对GSCs的免疫疗法有DCs疫苗、细胞疗法和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR-T）治疗。DCs疫苗是将含GSCs的肿瘤样本于体外刺激DCs，获得肿瘤相关抗原后再注射回体内，从而强化机体对肿瘤的免疫。传统的DCs疫苗仅针对肿瘤携带的抗原而忽视了肿瘤干细胞，导致胶质瘤易复发，因此为了减少复发、取得更好的治疗效果，需要在靶向肿瘤干细胞上作出更多努力。细胞疗法是一种过继免疫治疗，体外培养活化患者淋巴细胞，生成大量效应T细胞后再过继回患者体内从而杀伤肿瘤细胞。随着对免疫微环境认识的深入，细胞疗法也相应取得进展，体外实验表明，细胞毒性T淋巴细胞过继免疫疗法对肿瘤细胞和肿瘤干细胞都有较强的杀伤作用，但是临床应用还存在安全问题等诸多限制。CAR-T治疗是质粒重组的基因工程技术，将由非MHC限制性识别肿瘤相关抗原的单链抗体scFv、跨膜区及胞内信号区组成的重组质粒转染入T细胞，纯化扩增后获得所需T细胞，注入患者体内便可产生免疫作用^[41]。这种基于基因工程的免疫治疗在动物实验中效果良好，将是未来发展的重点方向，但就目前的技术水平而言还较难在临床中广泛应用。

4   展望

由于胶质瘤呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界线，通过外科手术难以完全切除，放疗化疗效果也不甚理想，现有的治疗方法只能暂时消除部分分化期肿瘤细胞，残留的肿瘤细胞对各种药物不敏感，使GSCs占比增加，并导致更为恶性的表型发生。恶性胶质瘤的研究虽不断深入但其临床治疗一直未取得较大突破，越来越多的证据表明GSCs是胶质瘤抗放疗化疗和复发的关键。GSCs可直接参与其生存微环境的构造、重塑，同时GSCs血管微环境、缺氧微环境、免疫微环境通过各自的调节机制和相互之间的交联作用，共同维持GSCs干性、肿瘤发生发展和抗放疗化疗性。GSCs与微环境之间并不是独立的，其相互调控机制复杂，深入研究这些调控机制将有利于解释胶质瘤的复杂多样性、难治愈性，并提供更多高效治疗靶点。

目前关于GSCs微环境治疗靶点的研究进展很多，靶点治疗效果在体内外实验中都得到了肯定，但靶向治疗技术还不够成熟，具体应用于人体还存在一些问题。很多涉及信号通路的治疗靶点缺乏特异性，并不是GSCs微环境所特有，抑制这些信号通路最终很可能影响机体正常细胞的生长发育。而且由于人体调节机制复杂，导致靶向治疗效率不高。另外还有些靶点抑制剂无法大量获取，并不适合广泛用于临床。然而在现有治疗恶性胶质瘤的各种方法中，靶点疗法依然是最理想的，多种靶点联合治疗意义很大，因此后续还有待更深入的研究。

GFAP⁺干细胞来源的胶质瘤与相对分化Nestin⁺或CNP⁺细胞来源的胶质瘤相比，前者自我繁殖能力强、恶性程度高，但是对药物的敏感度较强^[42]。因此，区分肿瘤细胞来源开发特定药物，结合针对GSCs的微环境等治疗靶点可进一步增进肿瘤治疗的效果。为此我们课题组正将干细胞定向分化神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞，再诱导发生异常的肿瘤转化，这样不仅可以探讨恶性胶质瘤的细胞起源和发生发展机制，而且为筛选致肿瘤化合物和胶质瘤敏感药物提供一个良好的平台。