0   引言

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是一种异质性血液恶性肿瘤，是发病率最高的一种非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）亚型，其发病率占成人非霍奇金淋巴瘤的30%~40% ^[1]。虽然临床上多种化疗方案，如利妥昔单抗、长春新碱、多柔比星、环磷酰胺和泼尼松等，大大提高了DLBCL患者的生存率，但仍有一部分DLBCL患者无法治愈，且容易复发^[1-2]。因此仍然需要进一步开发药物改善DLBCL预后，提高疗效。RG-7388，又称Idasanutlin，是由罗氏公司开发的全球首个口服的二代临床双微体2（murine double minute 2, MDM2）蛋白抑制剂^[3]。在骨肉瘤^[4]、急性髓系白血病^[5]、神经母细胞瘤^[6]等多种肿瘤中有抗肿瘤活性，但在DLBCL中的作用尚未见报道。为此，本研究探讨MDM2抑制剂RG-7388对DLBCL的抑制效应及其机制，为RG-7388在DLBCL中的临床运用奠定基础。

1   材料与方法

1.1   试剂与仪器

药物RG7388购自美国CSNpharm公司。IMDM培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。CCK8试剂盒购自于中国VICMED公司。PI/RNase Staining Buff er试剂购自美国BD公司。ClickiTplusEdU试剂盒购自美国ThermoFisher公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自中国索莱宝（Solarbio）公司。Caspase-Glo® 3/7酶活检测试剂盒购自Promega（北京）生物公司。抗体MDM2、p53、p27、p21、cdc25C、CDK6、cdc2、CyclinB1、PARP、Mcl-1、Bcl-x_L、Vinculin购自美国CST公司，GAPDH购自中国武汉三鹰（Protein-tech）公司。流式细胞仪FACSCalibur购自美国Bio-Rad公司。Synergy Multi-Mode Reader购自美国BioTek公司。

1.2   细胞培养

DLBCL细胞株SUDHL2和HBL1购自美国菌种保藏中心，由本实验室保存于含10%FBS的IMDM培养液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.3   细胞增殖检测

CCK8法检测细胞增殖：将SUDHL2和HBL1细胞（15 000个/孔）接种到96孔板中，待细胞丰度长至80%，弃去上清液，每组细胞分别用含0.5、1、2、5、10、20 μmol/L RG7388的10%FBS的IMDM培养液处理72 h，每孔加入10 μl CCK8，37℃、5% CO₂培养箱中避光孵育3 h。酶标仪测定450 nm处吸光值。

EdU法检测细胞增殖：将SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后，加入0.1%的EdU，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育4 h。洗涤和收集细胞沉淀后用100 μl 1×iClick固定剂室温避光固定15 min。随后用100 μl 1×iClick渗透和洗涤试剂处理静置20 min。200 μl 1×iClick反应液孵育30 min，洗涤液洗涤2次后PBS重悬沉淀后检测。

1.4   细胞周期检测

将SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞12h后，收集细胞并固定在70%预冷乙醇中，4℃过夜。PBS洗涤细胞后，200 μl PI/RNase染色缓冲液避光染色30 min，PBS洗涤3次后，200 μl PBS重悬。流式细胞仪检测细胞周期变化，FlowJo10软件分析结果。

1.5   细胞凋亡检测

Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡。SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后收集细胞，200 μl 1× Binding buffer重悬细胞，每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI避光孵育20 min，使用流式细胞仪进行检测。FlowJo10软件分析结果。

Caspase-Glo® 3/7酶活法检测细胞凋亡：将SUDHL2和HBL1细胞接种于96孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后，每孔细胞加入100 μl Caspase 3/7工作液，室温避光孵育1 h后，多功能酶标仪检测荧光强度。

1.6   蛋白表达检测

用不同浓度的RG7388（2、4、8 μmol/L）处理细胞72 h后，细胞裂解液冰上裂解细胞，离心收集上清液。10%SDS-PAGE进行凝胶电泳，将蛋白电转于100 mA恒流转移到0.45 μmol/L PVDF膜上。封闭液室温封闭2 h，4℃摇床孵育各类一抗过夜。TBST洗三次，每次10 min。二抗室温孵育1 h。TBST洗三次，每次10 min。用ECL化学发光试剂和化学发光成像仪（型号：ImageQuant LAS 4000 mini）检测。

1.7   统计学方法

运用SPSS27.0软件和GraphPad Prism 6软件统计分析和绘图。计量资料采用均数±标准差（x ±s）表示，两组以上均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2   结果

2.1   RG7388抑制SUDHL2和HBL1细胞增殖

CCK8法检测结果发现：在SUDHL2和HBL1细胞中，RG7388的IC₅₀分别为3.36和3.76 µmol/L，其抑制作用呈剂量依赖性，见图 1。EdU法检测结果表明，RG7388处理的SUDHL2（图 2A）和HBL1（图 2B）EdU阳性细胞数显著低于对照组（P < 0.001），且呈剂量相关性。这些结果表明RG7388可有效抑制SUDHL2和HBL1细胞的增殖。

图  1  CCK8法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞的增殖抑制作用

Figure  1  Inhibitory effect of RG7388 on the proliferation of SUDHL2 and HBL1 cells was detected by CCK8 assay

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图  2  EdU法检测不同浓度RG7388对SUDHL2(A)和HBL1(B)细胞的增殖抑制作用

Figure  2  EdU assay was used to detect the inhibitory effects of different concentrations of RG7388 on SUDHL2(A) and HBL1(B) cells

Compased with 0 μmol/L RG7388 group; **: P < 0.01; ***: P < 0.001, ****: P < 0.0001.

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2.2   RG7388阻滞SUDHL2和HBL1细胞周期

RG7388处理的SUDHL2和HBL1细胞中，随RG7388浓度的增加，G₁期细胞比例显著增高。2、4、8 µmol/L RG7388处理SUDHL2细胞中，G₁期细胞比例显著高于对照组（均P < 0.05）。与对照组相比，2、4、8 µmol/L RG7388处理HBL1细胞G₁期细胞比例显著升高（t=2.448, P=0.019; t=2.776, P=0.012; t=2.776, P=0.011）。在两种DLBCL细胞中，S期细胞比例明显随药物处理浓度增高而下降。G₂期细胞比例基本不变或只产生微弱变化。表明RG7388可诱导DLBCL细胞周期阻滞在G₁期，从而抑制细胞增殖，见表 1。

表  1  RG7388处理后SUDHL2和HBL1细胞周期变化

Table  1  Cell cycle of SUDHL2 and HBL1 cells treated with RG7388

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2.3   RG7388诱导SUDHL2和HBL1细胞凋亡

不同浓度RG7388处理48 h后，早期凋亡（Q2）和中晚期凋亡（Q3）细胞比例均显著增加。2、4、8 µmol/LRG7388处理的SUDHL2细胞中凋亡细胞比例分别为（37.9±5.46）%，（46.8 ±5.76）%和（59.0±5.32）%，显著高于对照组（8.59±2.63）%（F=56.34, P < 0.001）。HBL1细胞中，2、4、8 µmol/L RG7388处理组中凋亡细胞比例分别为（24.1±3.61）%，（33.9±4.29）% 和（50.0±4.57）%，也显著高于对照组（2.7± 0.93）%（F=89.21, P < 0.001），见图 3。与对照组比，随着RG7388浓度增高，Caspase3/7酶活性明显增高。其中在SUDHL2细胞中8 μmol/L RG7388处理组Caspase 3/7酶酶活性高达4倍，HBL1细胞中高达3倍，见图 4。表明RG7388促进了SUDHL2和HBL1细胞凋亡。

图  3  流式细胞术检测不同浓度RG7388对SUDHL2和HBL1细胞凋亡的影响

Figure  3  Effect of different concentrations of RG7388 on apoptosis of SUDHL2 and HBL1 cells detected by flow cytometry

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图  4  Caspase 3/7-Glo^TM酶活法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞凋亡的影响

Figure  4  Effect of RG7388 on apoptosis of SUDHL2 and HBL1 cells detected by Caspase 3/7-Glo^TM enzyme activity method

*: compared with 0 μmol/L group, *: P < 0.05.

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2.4   RG7388激活p53通路诱导SUDHL2和HBL1细胞周期阻滞和细胞凋亡

随药物浓度增高，p53蛋白表达水平增加；细胞周期负调控蛋白p27和p21表达水平增加；细胞凋亡相关蛋白PARP蛋白水平明显增高；细胞凋亡负调控蛋白Mcl-1、Bcl-x_L表达水平则呈明显递减趋势，见图 5。由此可见，MDM2抑制剂RG7388能激活p53通路从而抑制细胞周期和诱导细胞凋亡。

图  5  蛋白免疫印迹法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞周期和凋亡相关蛋白表达的调控作用

Figure  5  Western blot analysis of effect of RG7388 on the expression of SUDHL2 and HBL1 cell cycle and apoptosis-related proteins

Compared with 0 μmol/L RG7388 group, *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.

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3   讨论

DLBCL是一种最常见的异质淋巴瘤类型，约占所有淋巴样恶性肿瘤的20%^[7]。尽管大多数DLBCL患者对一线化疗疗法R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松）或类似方案有应答，但仍有约40%的患者会出现复发或转移^[8]。开发新的精准分子靶向药物治疗DLBCL具有重要意义。本研究结果表明MDM2抑制剂RG7388可在体外有效抑制DLBCL细胞增殖。由此可见，RG7388可能是一种潜在的DLBCL治疗药物。

RG7388是一种可口服的小分子MDM2蛋白抑制剂。MDM2是p53抑癌基因的负调控因子。临床前研究证实，RG7388作为单一药物可导致p53基因活化增加、细胞周期阻滞和凋亡^[9]。p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，在正常情况下不表达或低表达。然而，在生理应激下，其半衰期延长，导致p53在细胞核中积累，在细胞核中高表达，发挥转录因子的作用。p53可以结合并激活多种靶基因的表达，发生不同的细胞反应，包括DNA修复、细胞周期阻滞、衰老或凋亡。在正常生理条件下，p53水平保持在较低水平，不断被MDM2降解。MDM2是一种E3泛素连接酶。MDM2n端与p53结合，泛素化c端结构域的几个赖氨酸残基则靶向p53，对p53进行蛋白酶体降解。随着MDM2与p53结合的结构细节的阐明，以及对这种相互作用的重要性的认识，阻止MDM2与p53结合成为一种积极的治疗策略^[9-10]。抑制MDM2或恢复野生型p53蛋白的肿瘤抑制功能可有效抑制肿瘤形成。RG7388是p53-MDM2相互作用的第二代选择性抑制剂。与第一代抑制剂nutlins相比，其药理特性更佳，包括效力、生物利用度的提高以及对p53-MDM2结合位点的选择性。在临床前建模和模拟研究中，每日或间歇给药时RG7388均可有效激活p53通路，导致野生型p53细胞系周期阻滞或凋亡，最终实现肿瘤停滞^[11]。本研究发现RG7388处理的DLBCL细胞中，随着RG7388浓度的增加，DLBCL细胞增殖明显受到抑制、细胞周期阻滞在G₁期，细胞发生凋亡。RG7388对DLBCL细胞生长的抑制效应呈剂量依赖效应。这提示MDM2抑制剂RG7388也可能在DLBCL治疗中同样发挥重要作用。RG7388靶向抑制MDM2，负调控p53。本研究也发现RG7388处理的DLBCL细胞p53蛋白水平增加，可能就是由于MDM2被抑制，p53增加所致，与其机制作用相符。

本研究中RG7388处理后，p53蛋白稳定性增强，从而激活了p53下游相关通路。在细胞周期调控中，RG7388处理的DLBCL细胞中，细胞周期抑制蛋白p27、p21表达上调。与G2/M相关的周期蛋白有Cyclin B1、cdc2、cdc25C，这三个周期蛋白相互联系并促进真核细胞进入有丝分裂，在RG7388作用后随药物浓度明显递减，说明细胞未能进入细胞分裂。G₁/G₀期周期蛋白CDK6也递减，进而使细胞不能越过G₁/S期发生细胞阻滞。在细胞凋亡调控中，RG7388处理后，细胞凋亡相关蛋白PARP水平明显增高；细胞凋亡负调控蛋白Mcl-1、Bcl-x_L表达水平则呈明显递减趋势。这个结果与Vernooij等^[6]在神经母细胞瘤中的结果一致。

本研究不足之处：仅通过体外细胞实验探讨了MDM2抑制剂RG-7388对DLBCL细胞生长的抑制效应，后续还需要动物体内实验进一步论证其抑制作用。在临床运用方面，目前RG7388已进入临床Ⅲ期研究，是临床试验研究进展最快的小分子p53激活剂。但是相对于p53突变细胞系，RG7388只有适度的选择性，且RG7388消除p53野生型癌细胞的能力有限，RG7388的使用可能还会产生p53突变的耐药细胞群体^[12]。因此后续DLBCL治疗研究还可以联合其他靶向药物进一步精准治疗p53突变的耐药肿瘤。

总之，MDM2抑制剂RG7388抑制DLBCL细胞增殖，通过p53通路引起G₁期细胞阻滞并诱导细胞凋亡。RG7388可能是一种潜在的DLBCL治疗药物。