Construction and Validation of A Risk Model for Predicting Prognosis and Immunotherapy Response of Bladder Cancer Based on Cellular Senescence-related Genes
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摘要:目的
通过构建细胞衰老相关标志(SRS)风险评分模型评估膀胱癌的预后和对免疫治疗的反应，探讨SRS在膀胱癌中的临床应用价值。
方法从TCGA-BLCA筛选出细胞衰老基因，根据LASSO回归筛选出其中的细胞衰老相关标志基因。基于衰老标志基因构建膀胱癌风险评分模型分析TCGA-BLCA高、低风险组的生存差异和模型拟合度，单因素、多因素Cox回归分析膀胱癌预后危险因素。分析GEO-BLCA、IMvigor210数据库中高、低风险组的总体生存差异和免疫治疗反应。根据膀胱癌组织和正常癌旁组织中β-gal显色反应，明确膀胱癌组织中是否存在细胞衰老。
结果共筛选出8个细胞衰老标志基因，根据标志基因构建的风险评分中位数将患者分为高、低风险组。高风险组患者的5年生存率低于低风险组患者(训练集及验证集P < 0.05)，TCGA-BLCA和GSE13507患者1、3、5年OS的ROC曲线下面积分别为0.657、0.660、0.688和0.665、0.665、0.613。SRS风险评分可作为膀胱癌患者预后的独立危险因素，膀胱癌免疫治疗中反应组较非反应组的SRS风险评分更低(P < 0.05)。膀胱癌组织β-gal染色阳性，癌旁正常组织β-gal染色阴性。
结论膀胱癌组织中存在细胞衰老现象，SRS风险评分可以预测膀胱癌患者的临床预后，评分较低的患者可以从免疫治疗中获益。SRS是膀胱癌预后和免疫治疗反应的一个可靠的生物标志物。
Abstract:ObjectiveTo evaluate the prognosis and immunotherapy response of patients with bladder cancer by constructing a risk-score model of cellular senescence-related signature (SRS), as well as to explore the clinical application value of SRS in bladder cancer.
MethodsSenescence genes were screened from TCGA-BLCA, and cellular SRS genes were screened according to LASSO regression. A bladder cancer risk-score model was constructed based on the SRS genes to analyze the survival difference and model-fit degree of TCGA-BLCA high- and low-risk groups. Univariable and multivariable Cox regression was used to analyze the prognostic risk factors of bladder cancer. Overall survival differences of high- and low-risk groups in GEO-BLCA database were verified, and variations in immunotherapy responses were analyzed in IMvigor210 databases. According to the result of β-gal chromogenic reaction in bladder cancer and normal paracancer tissues, the existence of cell senescence was determined.
ResultsEight marker genes were screened, and patients were divided into high- and low-risk groups according to the median risk score constructed by the marker genes. The 5-year survival rate of high risk group was lower than that of low risk group (training and validation sets P < 0.05). The area under the ROC curve of TCGA-BLCA in 1-, 3-, and 5-year were 0.657, 0.660, and 0.688, and those for GSE13507 were 0.665, 0.665, and 0.613, respectively. SRS risk score can be used as an independent risk factor for the prognosis of patients with bladder cancer. The SRS risk score in the response group was lower than that in the non-response group during bladder cancer immunotherapy (P < 0.05). The β-gal staining of bladder cancer tissue was positive, but the β-gal staining of adjacent normal tissue was negative.
ConclusionCell senescence occurs in bladder cancer tissues. SRS risk score can predict the clinical prognosis of patients with bladder cancer, and patients with low score can benefit from immunotherapy. SRS is a reliable biomarker for the prognosis and immunotherapy response of bladder cancer.
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0 引言
膀胱癌是泌尿系统癌症中最常见和致命的恶性肿瘤之一。根据2021年全球癌症统计，2020年膀胱癌发病例115 949例，死亡84 695例，全球癌症排名中分别排第十和第十三位，其发病率和死亡率呈逐年升高的趋势[1]。虽然膀胱癌的治疗方式包括传统手术、化疗、放疗以及免疫治疗[2-3]，但由于膀胱癌术后复发和转移导致进展性膀胱癌的五年生存率仍较低[4-5]。因此发现潜在的膀胱癌进展、预后标志物对于膀胱癌的随访、免疫治疗评估意义重大。
细胞衰老是一种维持组织稳态的保护机制，用于清除病变细胞、功能失调的细胞以及机体不需要的细胞[6]。细胞衰老长期以来被认为是一种抗肿瘤的保护机制，通过这种机制，癌细胞被诱导衰老。然而，多项实验表明，衰老的癌细胞已被证明具有不同的增殖信号、避免凋亡、诱导血管生成、刺激侵袭和转移以及抑制肿瘤免疫的作用[7-8]。当衰老细胞没有被免疫系统清除并积累时，这种积累促进衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)释放细胞因子、生长因子、细胞外基质(ECM)成分和ECM降解酶导致衰老过程和肿瘤发展[9]。越来越多的研究表明细胞衰老标志物(senescence related signature, SRS)与肿瘤患者预后显著相关[10]，但其与膀胱癌的临床相关性和预后关系未见报道。为了系统评估膀胱癌中细胞衰老与预后之间的相关性，我们应用生物信息学计算方法建立了一种基于细胞衰老相关基因的风险模型，并探索其作为预后和免疫治疗反应生物标志物的潜在作用，为个性化治疗提供一定的参考。
1 资料与方法
1.1 数据获得和处理
患者的临床信息和转录谱来自癌症基因组图谱(TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov)数据库和基因表达图谱(GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)数据库。从TCGA-BLCA数据集中下载409例膀胱肿瘤患者和19例正常组织的基因表达及临床资料和预后数据。另外一个独立数据集GSE13507 [11](n=189)被纳入验证模型，将转录组数据与临床生存数据匹配，保留完整临床信息和随访资料的膀胱癌患者共计165例。在微阵列数据处理中，当基因与多个探针匹配时，使用平均表达值。IMvigor210[12]是一个由348例转移性尿路上皮癌患者使用抗PD-L1药物治疗的人群数据库，包括患者的药物反应、临床资料和生存信息从http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies/IMvigor210CoreBiologies下载，数据处理方法也在IMvigor210CoreBiologies包中提供。
1.2 膀胱癌中细胞衰老标志基因的筛选与风险模型构建
从细胞衰老网站获得基因列表[13](https://genomics.senescence.info/cells/)，本实验包含了其中的278个基因。我们首先筛选出膀胱癌组织与正常膀胱组织之间的细胞衰老相关的差异表达基因(DEGs)，根据阈值调整P < 0.01，|log2 (FC)| > 1。然后对细胞衰老基因进行单因素Cox风险回归分析，鉴定出细胞衰老相关预后基因(P < 0.001)。然后使用R包“veen”筛选出DEGs和预后基因的交集基因，并通过R包“circle”将它们之间的相关性可视化。使用R包“glmnet”构建SRS风险评分模型对TCGA中膀胱癌数据进行LASSO回归分析以得到最佳预测模型。通过10次交叉验证确定参数λ的最优值。根据SRS风险评分模型计算所得的风险评分中位值将TCGA数据集和GSE13507数据集中的膀胱癌患者分为高、低风险组。
1.3 IMvigor210数据库验证SRS风险评分
根据风险评分模型将IMvigor210中的患者进行高低风险分类，使用R包“survival”“survminer”“limma”“ggpubr”分析IMvigor210中高、低风险患者的免疫治疗反应差异和总生存差异。
1.4 临床样本
收集2022年2月—2022年8月贵州省人民医院10例行经尿道膀胱肿瘤电切或根性手术的膀胱癌患者新鲜癌和癌旁组织，其中5例成对，另5例仅含癌组织均制成冰冻切片。所有患者知情同意。本研究经贵州省人民医院伦理委员会批准。
1.5 细胞衰老染色
组织离体后用4%的多聚甲醛固定4 h，组织包埋剂包裹制作冰冻切片(8~10 μm厚)，β-半乳糖苷酶试剂盒检测膀胱癌组织和癌旁组织中半乳糖苷酶的表达。组织中的半乳糖苷酶阳性可将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)催化为蓝色产物，光学显微镜下观察切片中组织显蓝色为阳性，组织未见蓝色为阴性。
1.6 统计学方法
使用R version 3.5.1(https://www.r-project.org)、SPSS Statistics V25.0和GraphPad Prism 8.0进行数据分析和图形生成。采用非配对的t检验进行正态分布的变量比较，Wilcoxon秩和检验进行非正态分布变量的比较。分类变量的比较采用卡方检验。使用R包survminer绘制Kaplan-Meier生存曲线分析总体生存期。使用timeROC生成1、3和5年生存期的ROC，以评估患者SRS风险评分的预测效果。采用单因素和多因素Cox回归分析OS与SRS风险评分的相关性。所有统计分析均为双尾，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 膀胱癌衰老相关基因筛选
鉴定出TCGA-BLCA中膀胱癌组织与癌旁组织中的51个细胞衰老差异表达基因，其中21个基因表达上调，30个基因表达下调，见图 1。单因素Cox风险回归分析，发现共有63个细胞衰老基因与膀胱癌患者预后显著相关(P < 0.001)，见图 2。差异基因与预后基因存在17个交集基因(AURKA、CAV1、CHEK1、CCN1、DHCR24、EPHA3、GNG11、HDAC4、IGFBP5、IRF5、MMP9、MYC、MYLK、CAVIN1、SORBS2、STK40和TGFB1I1)(图片请扫描本文OSID码)。
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图 1 细胞衰老基因差异表达火山图Figure 1 Volcano plot of cellular senescence-related genes in TCGA database![]()
图 2 预后相关的细胞衰老基因森林图Figure 2 Forrest plot of cellular senescence-related genes related with prognosis2.2 膀胱癌预后相关细胞衰老标志基因构建及评价
利用LASSO-Cox回归对上述17个基因进行分析，根据LASSO回归分析得出的最佳λ值选择了8个细胞衰老相关标志基因(AURKA、DHCR24、EPHA3、IRF5、MYC、SORBS2、STK40、TGFB1L1)(图片请扫描本文OSID码)。基于8个细胞衰老相关标志基因在膀胱癌中的表达，我们构建了一个风险评分公式，风险评分= (0.0089×AURKA表达量)+(0.1233×DHCR24表达量)+(0.3092×EPHA3表达量)+(0.0851×IRF5表达量)+(0.0003×MYC表达量)+(0.0003×SORBS2表达量)+(0.0003×STK40表达量)+(0.0003×TGFB1I1表达量)(图片请扫描本文OSID码)。使用上述公式计算TCGA队列中的每例膀胱癌患者的风险评分，根据风险得分中位值将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存分析显示高风险组的总生存期明显短于低风险组(HR=2.062, 95%CI: 1.512~2.74, P < 0.0001)。高风险组的五年生存率为29.1%，明显低于低风险组的55.7%。1年、3年、5年AUC曲线下面积分别为0.657、0.660、0.688。单因素、多因素Cox回归分析显示，年龄、肿瘤分期和风险评分是膀胱癌患者的独立预后因素，见图 3。
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图 3 TCGA膀胱癌队列SRS高、低风险组总生存期曲线(A)、生存预后模型ROC曲线(B)、膀胱癌预后的单因素和多因素Cox回归分析(C)Figure 3 OS curves of BLCA patients of TCGA cohort based on SRS risk score(A), ROC curves of the prognostic model(B), and univariable and multivariable Cox regression analysis of BLCA prognosis in the TCGA cohort(C)2.3 GEO-BLCA验证SRS风险评分模型
膀胱癌GSE13507数据集被用于验证根据TCGA数据集SRS构建的风险模型，与TCGA SRS风险预测模型一样，GSE13507数据中的高风险膀胱癌患者的总体生存期较低风险组短(P < 0.05)。GSE13507数据1、3、5年ROC曲线下面积值分别为0.665、0.665、0.613，见图 4。
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图 4 膀胱癌患者(GSE13507)SRS高、低风险组总生存期曲线(A)和膀胱癌患者(GSE13507)生存预后模型ROC曲线(B)Figure 4 OS curves of GSE13507 based on SRS risk score(A) and ROC curves of the prognostic model in GSE13507(B)2.4 SRS在免疫治疗反应中的预测能力
我们在IMvigor210数据集中进行模型验证，SRS低风险组对免疫治疗反应更好(P=0.0043)，而且低风险组较高风险组总生存期更长(P=0.001)，免疫治疗反应组的SRS风险得分较免疫治疗非反应组的SRS风险得分更低，见图 5。这些结果表明，SRS风险评分较低的患者可能在ICIs免疫治疗中获益。
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图 5 IMvigor210数据集中膀胱癌患者免疫治疗反应组(CR/PR)和非反应组(SD/PD)的SRS风险得分(A)及SRS高、低风险组总生存曲线(B)Figure 5 Distribution of risk score between bladder cancer patients with CR/PR and SD/PD in IMvigor210 cohort (A), and curves for high and low SRS score groups(B)2.5 膀胱癌与癌旁组织中β-半乳糖苷酶染色差异
10例膀胱癌组织冰冻切片染色后光学显微镜下观察均有蓝色显示，β-半乳糖苷酶阳性率100%，5例癌旁组织冰冻切片中未见蓝色，β-半乳糖苷酶阳性率为0(表格请扫描本文OSID码)。Fisher精确检验分析膀胱癌组织与癌旁正常组织之间β半乳糖苷酶阳性率存在差异(P < 0.001)。提示膀胱癌组织中存在细胞衰老现象，癌旁正常组织中无细胞衰老现象，见图 6。
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图 6 癌旁组织(A, B)和膀胱癌组织(C, D)β-半乳糖苷酶的染色结果Figure 6 Staining results of β-galactosidase in adjacent normal tissues(A, B) and bladder cancer tissues(C, D)3 讨论
衰老是一个复杂的生物过程，具有细胞自主和旁分泌作用，对肿瘤微环境有重大影响[14-15]。SASP在短期内有积极抗肿瘤作用，但随着时间的延长，SASP可能导致肿瘤免疫抑制减弱，从而促进肿瘤的发展[16]。衰老细胞与肿瘤免疫浸润的相互作用在膀胱癌中未见报道，因此建立膀胱癌模型对于了解衰老分子是否重塑肿瘤微环境以及这种改变是否对膀胱癌患者的预后和免疫治疗反应具有重要意义，并且通过了解细胞衰老如何影响肿瘤免疫微环境的机制，为抗衰老治疗有效激活肿瘤免疫提供一个新思路[17]。本研究分析了膀胱癌中细胞衰老相关基因的表达模式、预后价值以及对肿瘤微环境的影响。利用LASSO回归方法，基于TCGA-BLCA数据集中8种衰老基因特征性的表达(AURKA、DHCR24、EPHA3、IRF5、MYC、SORBS2、STK40、TGFB1L1)构建了一种新的生存预测模型。此外，SRS在GSE13507、IMvigor210数据集中得到了很好的验证，高、低风险组在生存时间、免疫抑制剂治疗反应存在显著差异，多因素Cox回归分析发现SRS风险评分可作为膀胱癌患者的独立预后因素。β-半乳糖苷酶染色阳性出现在复制性细胞衰老和电离辐射诱导的细胞衰老中，普遍被认为是细胞衰老的标志[18]。本研究发现膀胱癌组织中β-半乳糖苷酶染色呈阳性，而正常癌旁组织β-半乳糖苷酶染色阴性，说明膀胱癌组织中存在细胞衰老现象。
本研究结果对临床指导有一定的意义：一方面，SRS风险评分高危患者总生存较差，提示高危患者应加强临床监测并采取相应措施，防止疾病复发和进展；另一方面，考虑到只有一部分患者能够从免疫检查点抑制剂中获益，我们需要更准确的并具有临床效用的生物标志物。细胞衰老相关信号不仅可以作为一个预后工具，而且可以作为个体化免疫治疗的指导。此外，针对细胞衰老相关基因Aurora抑制剂AKIs广泛应用于抗肿瘤治疗的药物临床试验中疗效显著[19]，MYC抑制剂Omomyc、CDK7抑制剂广泛应用于临床[20]，针对EPHA3受体型酪氨酸激酶的抗癌抗体可以抑制肿瘤微环境中的血管生成和肿瘤转移[21]，应用于晚期恶性血液病的药物临床试验取得良好的疗效[22]。
本研究也具有一些局限性：首先，在公共数据库中开发并验证的8个细胞衰老标志基因未在多中心队列中进行外部验证；其次，研究结果是否适用于接受免疫治疗的膀胱癌患者，未进行前瞻性临床试验验证。细胞衰老相关基因与免疫检查点抑制剂治疗反应之间的关联机制需通过基础实验进一步阐明。
综上，本研究发现并验证了一个基于8个细胞衰老相关基因的风险模型，是膀胱癌患者的独立预后因素。膀胱癌患者的SRS风险评分与膀胱癌预后、膀胱癌免疫治疗反应存在相关性。因此，筛选影响肿瘤免疫应答的细胞衰老基因并进一步研究其调控机制，可能有助于风险分层，为提高膀胱癌对免疫治疗的应答提供有希望的靶点。
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献：张鹏：实验实施，论文撰写杨倩：实验数据分析易东风：实验设计及论文审校 -
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图 1 细胞衰老基因差异表达火山图
Figure 1 Volcano plot of cellular senescence-related genes in TCGA database
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图 2 预后相关的细胞衰老基因森林图
Figure 2 Forrest plot of cellular senescence-related genes related with prognosis
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图 3 TCGA膀胱癌队列SRS高、低风险组总生存期曲线(A)、生存预后模型ROC曲线(B)、膀胱癌预后的单因素和多因素Cox回归分析(C)
Figure 3 OS curves of BLCA patients of TCGA cohort based on SRS risk score(A), ROC curves of the prognostic model(B), and univariable and multivariable Cox regression analysis of BLCA prognosis in the TCGA cohort(C)
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图 4 膀胱癌患者(GSE13507)SRS高、低风险组总生存期曲线(A)和膀胱癌患者(GSE13507)生存预后模型ROC曲线(B)
Figure 4 OS curves of GSE13507 based on SRS risk score(A) and ROC curves of the prognostic model in GSE13507(B)
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图 5 IMvigor210数据集中膀胱癌患者免疫治疗反应组(CR/PR)和非反应组(SD/PD)的SRS风险得分(A)及SRS高、低风险组总生存曲线(B)
Figure 5 Distribution of risk score between bladder cancer patients with CR/PR and SD/PD in IMvigor210 cohort (A), and curves for high and low SRS score groups(B)
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