0   引言

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，根据统计，2020年我国新增肺癌确诊病例81.6万例，肺癌相关死亡71.5万例^[1]。肺癌高死亡率的重要原因之一是早期多以肺结节形式存在，缺乏特异性临床症状，肿瘤的发生进展往往容易被忽视，因此大多数肺癌患者在初次就诊时已处于晚期。研究表明，Ⅰa期肺癌手术后5年生存率可达到80%，而Ⅲa~Ⅳ期肺癌患者5年生存率降至36%以下。因此，肺癌早诊早筛对改善预后有重要意义^[2]。本文就近年来较为新颖的肺癌相关生物标志物进行归纳总结，从而提高临床医生对肺癌早期诊断的认识。

肺癌诊断标志物有多种来源，其中血液生物标志物是最有前景的，基于血液的生物标志物可以协助肿瘤诊断、组织分型、预后判断以及指导治疗。由于肺癌的解剖学特点，痰、支气管灌洗、呼出气或气道上皮样本是特有的潜在的肺部或其他呼吸道肿瘤的生物标志物。这些生物标志物可能在早期提供一定的分子生物学信息，协助筛选早期肺癌。本文综述了目前比较有前景的生物标志物如miRNA、循环肿瘤DNA、DNA甲基化的发现和研究状况，同时对其他新兴的生物标志物或新技术进行归纳总结。

1   MicroRNA (miRNA)

miRNA是一类内源性非编码RNA，它广泛存在于动植物、真菌和病毒的基因组中，通过碱基互补配对的方法与靶基因的3’-UTR区互补，从而在转录后水平改变基因表达。miRNA在致癌和抑癌过程中扮演着至关重要的角色，不仅在细胞外的各种生物体液中极其稳定，而且极易获得，这些特征使miRNA成为了肿瘤诊断极具潜力的生物标志物。

有研究揭示了肺癌患者组中miR-31的表达明显高于健康对照组，该研究同时说明miR-31高表达组患者的平均生存期（25.23月）比低表达组（38.44月）短^[3]。另一项研究报道了miR-34家族可以有效地用于肺癌的诊断，其中miR-34a和miR-34c的过表达与无病生存期和总生存期相关^[4]。有研究分析了90名肺癌患者和85例健康者血浆中miR-944和miR-3662的表达，发现肺癌组中这些miRNA的表达比健康对照组升高，该研究同时说明了这些miRNA在晚期肺癌中的表达更高^[5]。

基于miRNA的非侵入性生物标志物的发现具有重要前景，但开发用于肺癌早期诊断的miRNA仍然面临许多挑战。首先，缺乏肺癌特异性miRNA，一种miRNA可能在多种癌症的血清中高表达。其次，miRNA的提取及检测过程需要规范化，包括样品获取和处理方法、检测平台及数据分析。用于肺癌早期诊断的miRNA相关临床研究多为单中心研究，且样本量偏少，导致研究结果的可重复性差，目前尚需大量临床研究数据对miRNA早期诊断肺癌的特异性进行论证。

2   循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）是坏死或凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和细胞外囊泡分泌释放的肿瘤DNA片段，携带有突变、缺失、插入、拷贝数异常的特征，广泛存在于体液中，包括血液、尿液、唾液等^[6]。它除了有肿瘤特异性的分子特征外，在晚期肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和胃食管癌组织中ctDNA水平也高于早期肿瘤。然而，ctDNA水平并不是简单地与肿瘤体积相关，而是在不同类型的肿瘤中存在差异^[7]。此外，ctDNA既可来自原发肿瘤，也可来自转移灶，因此ctDNA水平与肿瘤的病理状态密切相关。由于ctDNA来源不同，与单一的存在一定风险的实体肿瘤组织活检分析相比，液体活检结合ctDNA分析可能更能反映肿瘤基因的多样性，使其在癌症患者的诊断和管理方面优于组织活检分析^[8]。ctDNA提供了肿瘤患者的全景基因数据，可以同时反映肿瘤负荷水平和肿瘤对治疗反应的动态变化，在肿瘤临床诊断和治疗中具有广泛的应用潜力。

一项多中心临床研究纳入了192例可手术的肺占位性病变患者，其中64%的癌症患者处于Ⅰ期，对65个肺癌相关基因编码区进行基因测序，发现血浆ctDNA检测特异性达到96%，但敏感度偏低^[9]。ctDNA联合临床信息和血清生物标志物后，敏感度提高到了80%，说明血浆ctDNA可用于早期癌症检测，结合临床信息可提高检测性能。2018年报道了一种通过联合循环蛋白质水平和ctDNA突变来诊断八种常见癌症的研究，该研究共入组104例肺癌患者，敏感度为59%^[10]。目前ctDNA主要用于晚期癌症的检测，ctDNA应用于肺癌早期诊断的临床研究依然有限。

ctDNA在外周血中含量少，且容易与血浆蛋白结合，常规的提取效率不高。目前缺乏ctDNA样本采集和提取的标准流程。近年来与ctDNA有关的研究主要集中在晚期癌症，有研究显示：ctDNA可以用来评估手术等治疗后的预后^[11]，监测肿瘤早期复发，针对不同的基因突变制定个体化治疗方案^[12]。然而癌症早期组织中ctDNA浓度偏低，缺乏相关的研究经验^[13]。ctDNA昂贵的经济成本也是其走向临床的阻碍。

3   DNA甲基化

甲基化是核酸中一种重要的相对稳定的修饰方式，通过DNA甲基转移酶的作用，伴随DNA的复制过程遗传给子代DNA。研究表明大多数癌症患者的基因组水平均有DNA甲基化的异常，这种异常是很多肿瘤发生的重要原因。DNA甲基化通常发生在基因启动子区域，在调控下游基因表达中起关键作用，异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期阶段，并在癌症的发展过程中持续异常表达^[14]。

早在20年前，Esteller等^[15]用PCR法检测了22名非小细胞肺癌患者肿瘤组织及血清样本，有15例患者（68%）在肿瘤组织中检测到至少有一种高甲基化（共四种研究基因），其中11例表现出血清DNA中的异常甲基化。2017年，Ooki等^[16]建立了一个新的癌症特异性甲基化基因组（共六种研究基因）用于早期非小细胞肺癌的诊断，在43例ⅠA期试验组和42例对照组中，该甲基化基因组敏感度为72%，特异性为71%。Hulbert等^[17]筛选出3种DNA甲基化组联合检测用于肺癌的诊断，研究对象为CT图像上有高危肺结节的患者（150例Ⅰ~Ⅱ期NSCLC和60例对照组），术前采集血浆和痰液，DNA甲基化组在血浆标本中敏感度为98%，特异性为71%，相较于痰标本，血浆标本中的敏感度及特异性下降，该结论可能与肺癌特异性的侵袭模式——气道播散有关，同时说明了在无法获得痰液的情况下，血浆可以替代痰液标本进行DNA甲基化检测。

DNA甲基化检测技术随着表观遗传学及分子生物学技术的发展得到了快速发展。高通量的检测方法可以同时检测更多位点的甲基化，DNA甲基化研究能够提高早期肺癌的检出率。制定规范的甲基化检测技术标准有利于该技术进一步的临床应用。由于DNA甲基化状态的改变是可逆的，DNA去甲基化药物将是未来研究的焦点^[18]。

4   自身抗体

在肿瘤发病早期，异常表达的蛋白可刺激机体免疫系统产生大量的抗体，即肿瘤相关自身抗体（tumor associated autoantibody, TAAB）。在无症状早期阶段或影像学检测发现前，自身抗体（autoantibodies, AAbs）即可在患者的外周血中出现，这也提示通过检测自身抗体可以在很早期发现癌症。同时，自身抗体在外周血中稳定性好，使用常规的酶联免疫吸附实验就可进行抗体检测，技术简便易行^[19]。

单独的自身抗体分子敏感度和特异性都偏低，因此采用自身抗体谱以提高肺癌诊断的敏感度和特异性。一项对1 600例高危患者（61例肺癌，1/3处于Ⅰ期）的统计研究发现，7种抗体谱（EarlyCDT-Lung: p53、CAGE、NY-ESO-1、SOX2、GBU4-5、MAGE A4和HuD）有高特异性，达到91%，但敏感度偏低，仅有37%^[20]。EarlyCDT-Lung与CT影像具有一定的互补性，可联合应用于高危肺结节的管理。我国的七种自身抗体谱（p53、CAGE、GBU4-5、SOX2、MAGE-A1、PGP9 5、GAGE7）对早期肺癌也显示出有较好的诊断效能。Ren等^[21]开展的多中心、大样本的临床研究显示，对于Ⅰ、Ⅱ期非小细胞肺癌，7种抗体谱的敏感度分别为62%和59%，这些研究的敏感度远高于传统生物标志物（包括CEA、NSE和CYFRA21-1）。值得关注的是，该研究说明7种抗体谱联合低剂量计算机断层扫描显著提高了肺结节患者的诊断率。

在肺癌的早期诊断领域，肿瘤抗体谱初步显示出良好的特异性，但当前肿瘤相关抗体谱的诊断效能还不够理想，自身抗体谱的优势主要体现在与低剂量螺旋CT（LDCT）有效的互补。未来需要开发出更多与肺癌相关的自身抗体，进一步改进抗体检测的技术，以提高其在肺癌早期诊断领域的应用价值。

5   循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTCs）是指原发或转移性肿瘤组织流入血液循环的癌细胞，与肿瘤的转移和增殖密切相关，在肿瘤诊断、管理和治疗中有较好的应用前景^[22]。2018年的一项研究说明了CTCs的检测可用作筛查肺结节和诊断早期肺癌，联合CTCs水平和CEA可显著提高肺腺癌诊断的效能^[23]。此外，2022年的研究纳入了538例肺占位性病变患者，包括163例腺癌、71例鳞状细胞癌和48例小细胞肺癌，证实了在不同组织类型的肺癌中，CTCs联合血清生物标志物的诊断模型能提高不同组织类型肺癌的诊断效率^[24]。国内的一项研究对CTCs阳性患者进行血清液相色谱-串联质谱（LC-MS）代谢组学分析，认为CTCs的NGS检测联合代谢组学可能成为新的肺癌早期诊断肿瘤标志物^[25]。Ye等通过前瞻性研究构建了结合CTC等多种指标的早期肺癌预测模型，证实了应用该模型可以早期诊断恶性结节患者^[26]。

CTCs应用于癌症早期检测的最大挑战是极少数CTC细胞的富集，这些细胞通常以单个肿瘤细胞的形式存在于数百万血细胞中^[27]。病灶的体积越小，血液中CTCs的数量就越少，从而导致CTCs对早期肺癌诊断的敏感度偏低。研究表明，肺腺癌患者的CTCs数目可能与原发肿瘤体积有关^[28]。根据CTCs的物理和生物学特性，目前已有多种技术用于CTCs的富集，如免疫磁珠阴性富集、微流体装置富集、基于形态学富集的膜过滤等^[29]，仍需继续开发易于推广的、可以有效提高CTCs检测敏感度的技术及设备。

6   其他标志物

挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）诊断技术是一种方便快速、非侵入性的技术手段。VOCs是人体氧化应激等代谢过程产生的内源性化合物，可以通过多种技术捕获和分析，包括气相色谱/质谱法（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）、电子鼻（electronic nose, E-nose）、各种传感器。2021年发表的一项研究^[30]纳入了47例肺结节患者，收集他们的CT图像和VOCs数据，说明联合VOCs和CT检查对肺癌进行早期诊断可以达到97.3%的敏感度和100%的特异性。尽管现有的VOCs收集、富集、分析、统计技术都相对成熟，但目前仍缺乏单纯分析VOCs的临床研究。这主要是由于客观条件制约下，VOCs采集及分析过程缺乏标准化。另一个重要原因是，哪些VOCs可以作为诊断标志物鲜有共识。VOCs相较于其他检测方法，起步较晚，但发展潜力巨大。

随着核磁共振以及质谱（mass spectrum, MS）等分析平台的发展，肺癌的代谢组学相关研究也得以飞速进展。代谢组学通过分析内源性代谢物质（中间或代谢终产物）在体液及组织内的变化规律，提供了与肺癌发展及其微环境相关的代谢表型特征。代谢组学可检测的生物样本范围广泛，包括血液、痰液、尿液或呼出气冷凝液。Xie等^[31]进行的研究提出结合代谢组学和机器学习方法来早期诊断肺癌，该研究也显示了代谢生物组学对早期肺癌具有显著的诊断能力。代谢组学研究的主要问题在于目前检测的代谢产物并非肿瘤特异性表达，由于个体差异性和机体内环境的复杂性，缺乏足够的机制研究证明代谢物与肿瘤之间的联系。

7   总结

尽管现有的肺癌早期诊断方法具有巨大的潜力，但目前还没有单一的肺癌早期诊断生物标志物被常规用于临床检测。现有的部分生物标志物可以在多种肿瘤中异常表达，缺乏肺癌特异性生物标志物。对现有的生物标志物进行临床验证和应用尤为关键，但较开发性研究和回顾性验证需要更多的资源和时间。不同的检测方式各有优缺点，需要进一步从多维度比较各种诊断标志物的优缺点。通过不同方式整合有前景的生物标志物并筛选出最合适的组合也是可行的研究方向。在精准医疗时代，构建大数据整合采集平台，对已有的大量数据进行深度挖掘，可能对生物标志物的研究有所帮助。如何证明这些检测方法的成本效益，获得监管机构批准，这些也是在开发及筛选分子生物标志物时面临的一系列挑战。