0   引言

结直肠癌是最常见恶性肿瘤之一，发病率仍然高居全球第三，死亡率居全球第二^[1-3]。转移是CRC患者疗效不佳和高死亡率发生的重要因素^[4-5]。CRC发生发展过程中需要多种不同的表观遗传学机制驱动^[6]。类泛素样含PHD和环指域蛋白（ubiquitin-like PHD and ring finger domains, UHRF）1是一个多功能结构域蛋白，能够识别和修饰不同的染色质，从而发挥不同的生物学功能，特别在表观遗传学修饰方面^[7]。UHRF1通过运用其特殊的结构域来参与表观遗传标记的传递^[8-9]。UHRF1是一种已知的、负责维持细胞表观遗传的蛋白^[10-11]，被认为与细胞的快速增长和DNA修复密切相关^[12-13]。CRC中存在UHRF1过表达现象^[14]，并与转移和临床分期紧密相关。UHRF1将可能成为一种独立的生物标志物运用于肿瘤检测、进展和防治监测^[15]。

课题组前期研究发现UHRF1能够被多个miRNA结合而沉默^[16-17]，有望成为潜在的干预靶点，但具体的下游作用信号传递机制目前暂不明确。本研究旨在探究UHRF1对CRC生物学特性的影响及其可能的相关通路，进一步探讨其与CRC的关系及相关作用机制，为CRC诊断和防治提供新的思路。

1   材料与方法

1.1   组织和细胞来源

从癌症基因组图谱（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载并获得结肠腺癌（COAD）、直肠腺癌（READ）和正常结直肠组织的RNA测序数据（HTSeq-Counts和HTSeq-FPKM)。在排除总生存期（OS）值缺失或OS时间短（< 30天）的患者后，最终纳入了502例具有完整相关临床信息的患者。同时利用该机构收集的（2018年5月—2019年5月）新鲜保存于-80℃的术前未进行放化疗的CRC组织及匹配的超过5 cm范围的正常肠黏膜组织，共112例。该研究通过福建医科大学附属第一医院伦理委员会批准（批号：闽医大附一伦理医研[2019]021号）。

CRC细胞株SW480、HT29、HCT116、LOVO由福建医科大学药学院惠赠。

1.2   主要试剂与仪器

UHRF1抗体（美国Sigma公司），WNT3a、GSK3β、p-β-catenin和MMP9抗体（美国Abcam公司）；慢病毒包装载体、UHRF1过表达载体和UHRF1shRNA（上海吉凯生物公司），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），SYBR Green Real-time PCR（日本Takara公司），GAPDH抗体（美国CST公司），PVDF膜（中国Biosharp公司），Transwell小室（美国Thermo Fisher公司）。PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯），Stratagene Mx3000P PCR仪（美国Agilent公司），凝胶成像及分析系统（美国Bio-Rad公司），酶联免疫监测仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.3   实验方法

1.3.1   免疫组织化学

冷冻保存的组织取小块石蜡包埋固定，4 μm厚切片，抗UHRF1抗体以1:200的工作浓度检测组织中UHRF1蛋白的表达。磷酸盐缓冲液冲洗后，加入适量稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体（工作浓度1:1 000），37℃孵育10~30 min，用磷酸盐缓冲液冲洗。用苏木精对比染色5 min，中性树胶风干。荧光显微镜下观察。

1.3.2   慢病毒转染

构建UHRF1过表达慢病毒和UHRF1敲低（sh-UHRF1）慢病毒载体。SW480细胞用UHRF1过表达慢病毒感染，HCT116细胞用sh-UHRF1慢病毒感染。选择合适的MOI值加入病毒，同时加入共感染剂Polybrene。12 h后更换正常培养基。感染72 h后，在荧光显微镜下观察荧光表达。最后用嘌呤霉素进行细胞抗性筛选，只留下慢病毒感染的细胞，获得稳定表达的细胞系。

1.3.3   Real-time PCR实验

根据试剂盒说明，使用TRIzol试剂从新鲜临床标本组织或者培养的细胞中提取总RNA。反转录试剂盒用于RNA反转录得到cDNA。使用7500 real-time PCR系统进行RT-PCR分析。相对表达式F（倍数变化）= 2^-∆∆Ct进行分析和比较。引物设计如下：UHRF1（上游引物：5’-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3’；下游引物：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3’）；GAPDH（上游引物：5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3’；下游引物：5’-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3 ’。

1.3.4   蛋白质印迹实验

应用细胞裂解液充分裂解并收集总蛋白。制备10%SDS-PAGE凝胶并将60微克/孔蛋白质加入梳状孔中。电泳转染后，将PVDF膜封闭2 h。然后将PVDF膜与抗UHRF1、抗GAPDH、抗WNT3a、抗GSK3β、抗p-β-连环蛋白和抗MMP9在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤膜后，将其与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（1: 5 000）孵育2 h。再次洗膜并浸入适量的ECL试剂以测试凝胶成像系统中的结果。

1.3.5   肿瘤细胞生物学特性检测

EdU增殖实验：将各组细胞按1.5×10⁵个/孔接种于24孔板中。加入制备好的试剂EdU并继续孵育细胞2 h。用聚甲醇固定并渗透液体后，加入Click反应溶液。使用Hoechst 33342进行核染色。在荧光显微镜下观察到所有细胞核都被染成蓝色。

Transwell迁移实验：实验前12 h，将细胞更换为无血清培养基进行预处理。取300 μl细胞悬液加入Transwell小室上层，即每孔6×10⁴个细胞，加入700 μl含20%胎牛血清的培养基井板。在5%CO₂和37℃下孵育48 h。用棉签轻轻擦拭室上部的细胞，用PBS清洗，用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色液染色30 min。然后在显微镜下观察并拍照。

Transwell侵袭实验：提前将Matrigel胶添加到Transwell小室底部，使其凝胶化。与迁移实验一样，Transwell小室上层加入300 μl细胞悬液，每孔接种9×10⁴个细胞，下孔板加入700 μl含20%胎牛血清的培养基，培养48 h，处理方法同迁移实验。荧光显微镜下观察并拍照。

1.4   统计学方法

采用SPSS22.0软件分析，计数资料的比较采用卡方检验；计量资料用（x±s）表示，各计量资料之间组间两两比较时先进行多样本方差齐性检验；若方差齐，则采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   UHRF1在TCGA数据库中的表达及作用

在包括结肠癌和直肠癌在内的绝大部分癌组织的UHRF1 mRNA表达量明显高于对应正常组织，UHRF1在恶性肿瘤的发生发展中可能具有重要的作用（P < 0.001），见图 1A。UHRF1低表达组总生存期（OS）和疾病相关存活时间（DSS）均明显优于高表达组（P < 0.05），UHRF1高表达量是CRC患者不良预后因素，见图 1B~C。利用ROC曲线评价UHRF1表达量预测CRC患者生存时间，1、3和5年OS的AUC分别为0.634、0.652和0.771，见图 1D，具有良好的生存预后预测作用。

图  1  在TCGA数据中UHRF1的表达及与预后的关系

Figure  1  Expression of UHRF1 and its relationship with prognosis in TCGA data

A: Differences in UHRF1 expression between cancer tissues and normal tissues of 33 malignant tumors in the TCGA database.*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; B: Differences in the 5-year OS of CRC patients in high-/low-UHRF1-expression groups; C: Differences in 5-year DSS of CRC patients in high-/low-UHRF1-expression groups; D: The area under the ROC curve (AUC) was used to evaluate the expression of UHRF1 and thus predict the 1-, 3-, and 5-year OS of CRC patients.

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2.2   UHRF1在CRC临床样本中的表达

免疫组织化学检测结果显示：UHRF1在CRC癌组织中阳性表达率为72.32%（81/112），在癌旁正常组织中阳性表达率为25.0%（28/112, P < 0.05），见图 2A~B，表 1。RT-PCR结果示UHRF1 mRNA在癌组织中明显高于癌旁组织（P < 0.001），见图 2C。

图  2  UHRF1在临床样本组织中的表达及其作用

Figure  2  Expression of UHRF1 in tissues and its role in the clinical CRC cohort

A: Representative immunohistochemical staining for UHRF1 expression; B: UHRF1 expression in colorectal cancer tissues and adjacent tissues; C: Differences in UHRF1 mRNA expression levels between cancer tissues and adjacent normal tissues determined by RT-PCR; D: Differences in UHRF1 expression among distinct age groups; E: Differences in UHRF1 expression among distinct gender groups; F: Differences in UHRF1 expression among distinct T groups; G: Differences in UHRF1 expression among distinct N groups; H: Differences in UHRF1 expression among distinct M groups; I: Differences in UHRF1 expression among distinct tumor TNM staging groups; J: Differences in 3-year OS of CRC patients among high/low UHRF1 expression groups; K: AUC was used to evaluate UHRF1 expression to predict 1-, 2-, and 3-year OS in the clinical CRC cohort.

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表  1  UHRF1表达与CRC患者临床病理特征的关系

Table  1  Relationships between UHRF1 expression and clinicopathological characteristics in CRC patients

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UHRF1 mRNA表达量男性高于女性（图 2E）；T3+4组高于T1+2组（图 2F）；N+组高于N0组（图 2G）；M1组高于M0组（图 2H）；且随着TNM分期升高，表达量也随着升高（图 2I），但与年龄无关（P > 0.05）见图 2D。UHRF1蛋白表达量与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关（P < 0.05），与患者性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤直径无关（P > 0.05），见表 1；均提示UHRF1高表达与不良的临床病理特征密切相关。

UHRF1低表达患者的3年OS明显优于高表达患者（P < 0.05），见图 2J。1、2和3年OS的AUC分别为0.777、0.722和0.665，见图 2K，再次验证UHRF1具有良好的预后预测作用。

2.3   CRC细胞株筛选和慢病毒转染结果

检测4株细胞株UHRF1 mRNA和蛋白的表达，UHRF1 mRNA和蛋白表达从高到低分别是HCT116、LOVO、HT29、SW480细胞，见图 3A~B。因此选用SW480细胞作为过表达转染载体，HCT116细胞作为敲减转染载体。

图  3  UHRF1 mRNA和蛋白在不同细胞中的表达

Figure  3  UHRF1 mRNA and protein expression in different cells

A: UHRF1 protein expression in four CRC cell lines; B: UHRF1 mRNA expression in four CRC cells; C: The protein expression of UHRF1 in SW480 cells after lentivirus transfection; D: Expression of UHRF1 mRNA in SW480 cells after lentivirus transfection; E: UHRF1 protein expression in HCT116 cells after lentivirus transfection; F: UHRF1 mRNA expression in HCT116 cells after lentivirus transfection.

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转染后，SW480细胞中UHRF1 mRNA和蛋白表达量明显高于NC组和Control组（P < 0.01），证实过表达组细胞株构建成功，见图 3C~D。

敲减后，HCT116细胞sh-UHRF1敲减组的UHRF1 mRNA和蛋白的表达量较NC组和Control组明显降低（P < 0.01），表明敲减组细胞株构建成功，见图 3E~F。

2.4   CRC细胞中UHRF1的表达与WNT/MMP9信号通路的关系

转染过表达后，Western blot结果显示，随着UHRF1表达量的增加，WNT信号通路中关键蛋白WNT3a和GSK3β的表达量增加，而p-β-catenin的表达量显著降低，MMP9表达量增加。在此基础上，加入了IWP-2（WNT拮抗剂），发现原来WNT信号通路中表达增加的相关蛋白均降低，见图 4。

图  4  CRC细胞中UHRF1调控WNT信号通路相关蛋白的表达

Figure  4  UHRF1 regulated the expression of WNT signaling pathway-related proteins in CRC cells

A: The upregulation or downregulation of UHRF1 affected the WNT signaling pathway and ultimately induced changes in the expression of the matrix metalloproteinase MMP9; B: Expression levels of WNT signaling pathway-related proteins and MMP9 in each group.*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001.

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sh-UHRF1敲低后，UHRF1表达明显降低，WNT3a和GSK3β的表达降低，MMP9表达量下降；使用HLY78（WNT激活剂）后，相关蛋白的表达趋于恢复，见图 4。因此，在结直肠癌中UHRF1可能通过调节WNT信号通路影响基质金属蛋白酶MMP9的表达。

2.5   UHRF1对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

EdU结果显示：过表达组增殖细胞数较NC组和Control组明显增多，使用抑制剂后UHRF1+IWP-2组较过表达组显著降低（P < 0.05），见图 5A；而在sh-UHRF1组中，随着UHRF1表达的降低，细胞增殖数目也随之减少（P < 0.05），加入WNT活化剂后细胞增殖率明显上升（P < 0.05），见图 5B。

图  5  UHRF1通过WNT信号通路影响结直肠癌细胞增殖

Figure  5  UHRF1 affected the proliferation of colorectal cancer cells through WNT signaling pathway

A: The pathway inhibitor IWP-2 could reverse the changes in SW480 cell proliferation induced by UHRF1 overexpression; B: The application of the WNT pathway activator HLY78 could increase the decline in HCT116 cell proliferation after silencing UHRF1.

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Transwell迁移实验结果显示：过表达组细胞数明显较NC组和Control组多（P < 0.05），并且过表达组通过IWP-2处理后细胞数明显低于未经拮抗剂处理组（P < 0.05），见图 6A。敲减组迁移数明显低于NC组和Control组（P < 0.01），而sh-UHRF1+HLY78组明显高于敲减组（P < 0.05），见图 6B。

图  6  UHRF1通过WNT信号通路影响结直肠癌细胞的迁移和侵袭

Figure  6  UHRF1 affected migration and invasion of colorectal cancer cells through WNT signaling pathway

A: Migration of UHRF1-overexpressing cell lines; B: Migration of UHRF1-silenced cell lines; C: Invasion of UHRF1-overexpressing cell lines; D: Invasion of UHRF1-knockdown cell lines.

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Transwell侵袭实验结果示：过表达组细胞数明显多于NC组和Control组（P < 0.01），且明显高于UHRF1+IWP-2组（P < 0.01），见图 6C。敲减组细胞数明显低于NC组和Control组，sh-UHRF1+HLY78组细胞数高于敲减组（P < 0.05），见图 6D。

3   讨论

UHRF1基因编码蛋白是一个多功能结构域蛋白，包含UBL、PHD和TTD结构域、RING finger功能域和SET-环指状结构域，能够识别和修饰不同的染色质，在细胞增殖、DNA损伤与修复、周期调控和细胞损伤放射敏感性等方面发挥重要作用^[18]。UHRF1是一个重要的表观遗传调控因子，是整合表观遗传信息的关键蛋白质，通过其特殊域参与表观遗传过程，进一步调节肿瘤的生物学特性^[19]。

研究表明，UHRF1在包括CRC在内的多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用^[20-22]，虽然具体的调控机制尚未完全阐明。UHRF1在结直肠癌中表达上调，并与结直肠癌的进展有关^[23]，CRC细胞中DNA甲基化的维持高度依赖于UHRF1，因此UHRF1耗竭迅速诱导DNA去甲基化作用^[24]。本研究揭示了UHRF1在具有淋巴结转移、远处转移和高TNM分期不良预后因素的CRC患者中明显高表达，可能是影响CRC患者预后的一个因素，3年随访结果显示UHRF1高表达提示不良的预后，且具有较为稳定可靠的预后预测能力，更加可靠的证据需要等待5年随访结果进一步评估预后情况。UHRF1蛋白还与细胞增殖和分化能力密切相关，增殖能力越强和分化程度越低的细胞中UHRF1表达越高。本研究还发现UHRF1的过表达可增强CRC的增殖、迁移和侵袭能力。UHRF1基因沉默后，CRC细胞的这些生物学特性受到抑制，这与UHRF1的促进增殖作用密切相关，这与课题组前期研究结果相一致^[16-17]，同时在体内外也验证了UHRF1在CRC中的重要作用。亦有研究发现SHMT2敲低可通过降低UHRF1的表达进而抑制CRC的增殖并诱导细胞周期阻滞，表明UHRF1可能与CRC细胞周期有关^[25]，但UHRF1影响侵袭、迁移能力的具体机制还需要进一步探索。

WNT信号通路是细胞生长发育过程中传递生物信息的重要通路，是一个复杂的蛋白质网络。WNT信号通路参与调节肿瘤微环境的形成。通过级联信号传递，可导致EMT、肿瘤细胞转移和肿瘤干细胞特性增强^[26]。同时，无论是乳腺癌、肺癌、肝癌，甚至CRC^[27]，这些肿瘤的发生均被认为与WNT信号通路有关^[28-30]。因此，UHRF1作为整合遗传信息的重要分子，也可引起异常细胞增殖和肿瘤形成，UHRF1和WNT信号通路之间是否存在相关性目前尚不清楚。本研究验证了UHRF1可以通过WNT信号通路调节CRC细胞中基质金属蛋白酶MMP9的表达，从而影响CRC迁移和侵袭的生物学特性，进一步揭示了UHRF1发挥作用的内在机制。UHRF1也可能通过其他作用机制发挥作用，有研究发现UHRF1可能介导的泛素化和DNA甲基转移酶1（DNMT1）的降解，导致启动子CpG岛的去甲基化和STAT1的过表达，进而促进CRC的生长^[31]。

综上所述，本研究探索了UHRF1如何介导其在CRC中的促癌作用。但目前的研究仅基于细胞水平的实验研究，即体外水平。同时，我们也在思考这个系统中是否有其他分子参与，UHRF1是否是这个调控的起点，是否还有其他的信号通路，这有待未来进一步的研究和发现。本研究发现UHRF1基因可通过调控WNT信号通路影响CRC增殖、迁移和侵袭，希望为结直肠癌的分子靶向治疗提供新的可能。