0   引言

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，是人类癌症死亡的第二大常见病因，发病率在所有癌症中排第三位，趋于年轻化^[1-3]。探索与结肠癌相关的基因标志物，研究结肠癌发展过程中的分子调控机制，是当前结肠癌学术研究中的主要方向。细胞周期蛋白A2（Cyclin A2, CCNA2）是细胞周期蛋白家族成员，其可以通过结合cdk2和cdc2，调控细胞周期从S期向G₂期转变^[4]。CCNA2具有多种生物学功能，例如细胞骨架动力学和细胞运动等^[5]。同时，CCNA2影响恶性肿瘤的免疫浸润，与淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌等多种癌症相关^[6]。CCNA2与多种肿瘤预后关系的研究在国内外均有报道。CCNA2与多种肿瘤的免疫浸润相关，但CCNA2影响结肠癌免疫微环境的机制尚不明确，为进一步探索CCNA2与结肠癌免疫微环境及患者预后的关系，本研究从免疫浸润的角度探讨CCNA2导致结肠癌患者预后不佳的潜在分子机制，为结肠癌的诊治提供新思路。

1   资料与方法

1.1   数据整理及分析

从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下载494例患者（其中肿瘤组织453例，非肿瘤患者正常组织41例）基因表达（RNA-seq）数据和临床病理资料。收集2019年7月—2024年7月湖南师范大学附属岳阳医院75例结肠手术标本（肿瘤组织标本52例，正常组织标本23例）。纳入标准：（1）经病理诊断确诊为结肠癌患者；（2）术前未经放疗、化疗，未服用过靶向药物；（3）临床资料完整。排除标准：（1）转移性肿瘤，合并其他部位恶性肿瘤患者；（2）合并其他严重疾病患者。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经湖南师范大学附属岳阳医院（岳阳市人民医院医学伦理审查委员会）批准（科研文2024015）。

1.2   免疫组织化学检测

采集手术患者的结肠组织，免疫组织化学法处理标本：石蜡包埋切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、PBS修复液抗原修复、过氧化物酶温室孵育、滴加CCNA2抗体（英国Abcam公司，1:250）孵育过夜、加入HRP二抗免疫显色试剂、DAB染色、中性树胶封片。染色强度评分：不着色（0分）、弱（1分）、中（2分）、强（3分）；阳性细胞比例评分：<20%（1分），≥20%~30%（2分），≥30%~40%（3分），≥40%（4分）。CCNA2蛋白表达总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度评分；最终评判：<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.3   CCNA2表达差异分析

根据湖南师范大学附属岳阳医院搜集到的75例手术标本及TCGA数据库中494例患者组织基因表达数据，分析肿瘤组织与正常组织中CCNA2表达水平并绘制箱式图。同时配对化分析来自同一患者的正常和肿瘤样本中的CCNA2表达情况并绘制配对连线散点图。

1.4   生存分析

使用Survival和survmine函数进行生存分析，记录生存时间跨度为0~11.69年，surv_cutpoint函数确定最佳截断值，将453例肿瘤组织样本根据最佳截断值分为高表达组和低表达组。比较两组间总体生存期、疾病特异生存期、无进展间隔期的差别。

1.5   临床病理特征分析

根据TCGA数据库453例肿瘤组织及湖南师范大学附属岳阳医院52例结肠手术肿瘤组织的临床病理特征数据（包括性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤大小、分化程度、病理分期、T、N、M分期）进行差异分析，评估CCNA2表达程度与临床病理特征间关系。

1.6   免疫浸润分析

采用“CIBERSORT”包量化分析结肠癌患者中的免疫细胞评分，并分析22种免疫细胞（LM22）的免疫浸润程度与CCNA2的表达相关性。根据CCNA2的表达程度绘制箱式图及线性相关图。

1.7   基因富集分析

从GSEA官网下载基因集“Molecular Signatures Database”并进行GSEA基因富集分析，以Hallmark基因集作为GSEA的目标集合，用enrichplot包绘制富集曲线图。

1.8   统计学方法

使用RStudio（Version: 2023.12.0+369）、SPSS 26.0进行统计学分析及图片处理绘制。使用Wilcoxon秩和检验、配对样本T检验比较正常组织与肿瘤组织CCNA2表达差异。使用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验和χ²检验分析CCNA2表达水平与临床病理特征之间的关系。使用Log rank检验进行生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   CCNA2在结肠癌组织中的表达

在TCGA数据库494例数据中，共有肿瘤组织453例，正常组织41例。与正常组织对比，CCNA2在肿瘤组织中的表达明显升高（P<0.001），见图1A。配对样本分析提示，CCNA2在结肠癌组织中的表达程度显著高于与之配对的正常组织（P<0.001），见图1B。为验证上述结果，采用免疫组织化学法检测湖南师范大学附属岳阳医院结肠术后52例肿瘤组织及23例正常组织中CCNA2表达情况。结果显示，结肠癌组织中部分肿瘤细胞呈核染色及弱胞质染色，且结肠癌组织中CCNA2蛋白表达明显高于正常组织（P<0.001），见图2、3。

图  1  TCGA数据库中CCNA2在正常组织和肿瘤组织中的差异表达

Figure  1  Differential expression of CCNA2 in normal and tumor tissues in the TCGA database

A: differences in CCNA2 expression between 453 cases of tumor tissues and 41 cases of normal tissues; B: matching map of CCNA2 expression in the same patient.

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图  2  CCNA2在不同组织中的免疫组织化学染色情况

Figure  2  Immunohistochemical staining of CCNA2 in different tissues

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图  3  肿瘤组织与正常组织CCNA2免疫组织化学评分比较

Figure  3  Comparison of CCNA2 immunohistochemical score between tumor tissues and normal tissues

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2.2   CCNA2与结肠癌患者临床病理特征的关系

结果显示，病理分期Ⅰ期（P=0.036）、Ⅱ期（P=0.02）结肠癌组织中的CCNA2表达程度显著高于Ⅳ期，见图4A。T1/T2期结肠癌组织的CCNA2表达程度显著高于T3/T4期（P=0.026），见图4B。N0期结肠癌组织中CCNA2表达程度显著高于N1期（P=0.024）、N2期（P=0.025），见图4C。M0期结肠癌组织的CCNA2表达程度显著高于M1期（P=0.03），见图4D。同时，CCNA2在正常组织中表达程度均显著低于所有病理分期的结肠癌组织（P<0.001），见图4E。湖南师范大学附属岳阳医院52例手术患者的肿瘤组织标本相关性分析结果显示，CCNA2表达程度与性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤大小、分化程度、N分期差异均无统计学意义（P>0.05），而与病理分期（P=0.023）、T分期（P=0.019）、M分期（P=0.048）差异具有统计学意义，见表1。

图  4  CCNA2与结肠癌临床病理特征关系图

Figure  4  Relationship between CCNA2 and clinicopathological features of colon cancer patients

A: relationship between CCNA2 expression level and tumor pathological stage; B: relationship between CCNA2 expression level and T stage; C: relationship between CCNA2 expression level and N stage; D: relationship between CCNA2 expression level and M stage; E: differences in the expression of CCNA2 between normal tissues and colon cancer tissues at different pathological stages.

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表  1  52例结肠癌患者CCNA2表达水平与临床病理特征的关系

Table  1  Relationship between CCNA2 expression level and clinicopathological features of 52 colon cancer patients

Clinicopathological features	Number of cases	High CCNA2 expression group (n=32)	Low CCNA2 expression group (n=20)	χ2	P
Gender				0.600	0.439
Male	37	24(64.9%)	13(35.1%)
Female	15	8(53.3%)	7(46.7%)
Age (years)				0.002	0.693
> 65	34	21(61.8%)	13(38.2%)
≤65	18	11(61.1%)	7(38.9%)
Primary site				1.300	0.254
Left semicolon	26	18(69.2%)	8(30.8%)
Right semicolon	26	14(53.8%)	12(46.2%)
Tumor size (cm)				0.033	0.855
≥5	19	12(63.2%)	7(36.8%)
<5	33	20(60.6%)	13(39.4%)
Differentiation				0.068	0.795
Well	12	7(58.3%)	5(41.7%)
Moderate and poor	40	25(62.5%)	15(37.5%)
Pathologic stage				5.200	0.023
Ⅰ-Ⅱ	26	20(76.9%)	6(23.1%)
Ⅲ-Ⅳ	26	12(46.2%)	14(53.8%)
T stage				5.525	0.019
T1-T2	18	15(83.3%)	3(16.7%)
T3-T4	34	17(50.0%)	17(50.0%)
N stage				0.123	0.746
N0	27	16(59.3%)	11(40.7%)
N1-N2	25	16(64.0%)	9(36.0%)
M stage				3.900	0.048
M0	39	27(69.2%)	12(30.8%)
M1	13	5(38.5%)	8(61.5%)

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2.3   CCNA2与结肠癌患者生存的关系

根据计算出的最佳截断值（5.95）为分界点，将453例结肠癌肿瘤样本分为低表达组与高表达组。发现CCNA2高表达组的总生存期（OS）（P=0.0056）、无进展间隔期（PFI）（P=0.0039）、疾病特异性生存期（DSS）（P=0.013）均显著长于低表达组，见图5。

图  5  不同CCNA2表达组结肠癌患者生存曲线

Figure  5  Survival curves of colon cancer patients in different CCNA2 expression groups

OS: overall survival; DSS: disease specific survival; PFI: progress-free interval.

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2.4   结肠癌中CCNA2相关基因信号通路分析

将TCGA数据库中453例结肠癌样本根据CCNA2中位表达水平分为高表达组和低表达组（中位表达水平5.850）。GSEA分析显示，雄激素响应元、IL6-JAK-STAT3信号、干扰素α、MYC-V2靶点、胰腺β细胞等基因通路在CCNA2高表达时富集（均P<0.05），见图6A，而顶端连接复合物、胆汁酸代谢、凝血、上皮间充质转化、Hedgehog、Wnt/β-Catenin、KRAS等基因通路在CCNA2低表达时富集（均P<0.05），见图6B。

图  6  CCNA2不同表达程度基因通路富集分析

Figure  6  Gene pathway-enrichment analysis based on different expression levels of CCNA2

A: enrichment analysis of CCNA2 high-expression gene pathway; B: enrichment analysis of CCNA2 low-expression gene pathway.

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2.5   结肠癌CCNA2免疫浸润相关性分析

通过LM22矩阵及CIBERSORT算法分析，计算出了结肠癌中22种免疫细胞比例谱，见图7A。箱式图显示，记忆CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、巨噬细胞M1、树突细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量在CCNA2高表达组中显著升高（均P<0.05），调节性T细胞、巨噬细胞M0等免疫细胞数量在CCNA2低表达组中显著升高（均P<0.05），见图7B。线性相关图显示，有8种免疫细胞浸润数量与CCNA2表达程度呈线性相关：CCNA2的表达与调节性T细胞和巨噬细胞M0的浸润呈负相关（均P<0.05），与活化树突状细胞、巨噬细胞M1、记忆CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的浸润呈正相关（均P<0.05），见图8。

图  7  结肠癌中免疫细胞浸润比例热图(A)及CCNA2不同表达程度间22种免疫细胞浸润丰度比较图(B)

Figure  7  Heatmap of immune-cell infiltration proportions in colon cancer (A) and comparison chart of the abundance of 22 immune-cell infiltrations across different expression levels of CCNA2 (B)

*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ns: P>0.05.

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3   讨论

CCNA2属于细胞周期蛋白家族成员，最早发现于非洲爪蟾的组织培养细胞系中^[7]。其通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases, CDK）促进细胞周期进入G₁期，并调节S期DNA的合成，从而保证细胞周期的有序进行^[8]，CCNA2转录起始点的遗传变异与肺癌、肝癌、结直肠癌的侵袭、转移、复发、化疗耐药相关，导致患者不良预后^[9-10]。

TCGA数据库分析得出，CCNA2在肿瘤组织中表达程度显著高于正常组织，同一患者间肿瘤与癌旁组织对比，也得到同样结论。免疫组织化学实验与TCGA数据库实验结果一致。生存分析提示CCNA2低表达组患者预后不良。Liu等的研究也取得了类似的结论，CCNA2在结肠癌组织中表达显著高于正常组织，且CCNA2表达上调与结肠癌患者存活率增加相关^[11]。

临床病理特征分析提示，结肠癌中CCNA2的表达与病理分期、TNM分期相关，且Ⅰ期、Ⅱ期及早期T、N、M分期的结肠癌组织中CCNA2表达程度更高。本研究进一步分析了湖南师范大学附属岳阳医院52例结肠癌患者数据，结果显示CCNA2表达与病理分期、T分期、M分期相关（P<0.05），但与N分期无显著相关性，这可能与样本量小有关。结合TCGA数据库与临床免疫组织化学分析，CCNA2与结肠癌的肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移相关。

GSEA分析得出，CCNA2低表达时有顶端连接复合物、上皮间充质转化、Hedgehog信号、Wnt/β-Catenin、KRAS等信号通路富集。顶端连接复合物、Hedgehog信号通路、上皮间充质转化通路活化时可促进癌症的发生及侵袭^[12-14]。在结肠癌中，APC等位基因缺失可激活Wnt/β-Catenin信号通路，促进肿瘤细胞的自我更新及生长^[15]。Wnt/β-Catenin作为致癌信号通路，可减少免疫细胞浸润，促进肿瘤免疫逃逸^[16]。研究表明，CCNA2可稳定axin/GSK3破坏复合体促进β−连环蛋白降解，且CCNA2表达降低时，β−连环蛋白积累增加^[17-18]。结合本实验结果，CCNA2表达降低时，Wnt/β-Catenin信号通路活跃促进免疫逃逸，增加肿瘤侵袭性。KRAS信号通路可以影响免疫细胞募集、激活、分化，使肿瘤细胞逃避免疫监视，促进肿瘤的发展^[19]。

调节性T细胞在肿瘤微环境中阻碍抗肿瘤免疫，促进肿瘤发展，且其抑制过度免疫反应的功能成为抗肿瘤免疫的主要障碍^[20]。研究表明，KRAS突变结肠癌患者CD4 T细胞的浸润程度降低，调节性T细胞浸润升高^[21]。Zdanov等的研究证明，KRAS通路活跃情况下可以促进常规T细胞向调节性T细胞转化^[22]。同时，在胃癌中Wnt/β-Catenin激活可增加调节性T细胞浸润，阻断此通路能减少调节性T细胞数量并抑制胃癌进展^[23]。本研究结果提示，CCNA2低表达时KRAS、Wnt/β-Catenin通路表达活跃，且调节性T细胞浸润增加。CCNA2可能通过上述通路促使肿瘤组织逃避免疫识别。巨噬细胞M0可极化成有抗肿瘤作用的M1型和促肿瘤作用的M2型^[24]。免疫浸润分析结果提示，CCNA2高表达时，M1型巨噬细胞浸润增加。随着CCNA2表达下降，M1型巨噬细胞逐渐减少，M0型巨噬细胞增多，可能使结肠癌组织的侵袭性进一步增加。

随着病理分期增加，CCNA2的表达逐渐下降，但正常组织中CCNA2表达仍远低于Ⅳ期肿瘤组织。CCNA2表达活跃能加快细胞周期进程，促进细胞从间期向有丝分裂期转变，促进细胞增殖分裂^[25]。在正常组织向肿瘤组织发展的过程中，CCNA2的表达升高，其可能影响细胞周期，促进细胞过度异常增殖分裂，导致肿瘤的发生。而随着病理分期的增加，肿瘤恶性程度升高，CCNA2表达降低，其可能通过KRAS、Wnt/β-Catenin通路影响免疫浸润，募集调节性T细胞，促进肿瘤免疫逃逸。因此，CCNA2表达升高可能促进正常组织向肿瘤组织转变，同时其表达程度降低可进一步影响免疫浸润从而增加结肠癌的侵袭性，导致不良预后。

综上，本研究证实了CCNA2在结肠癌组织中高表达，其表达缺失是结肠癌预后的不良因素。随着CCNA2表达程度降低，其通过KRAS、Wnt/β-Catenin通路募集调节T细胞，减少免疫细胞浸润，使结肠癌细胞逃避免疫识别，导致肿瘤恶性程度及侵袭性增加。CCNA2通过调节免疫浸润影响结肠癌患者预后，有望成为结肠癌患者诊断及治疗的分子标志物。