0   引言

宫颈癌(cervical cancer)是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，位于女性癌症相关死亡原因第四位^[1]。由于缺乏早期的临床症状，宫颈癌早期诊断率较低，患者的五年生存率仅为30%~50%^[2]。宫颈癌临床治疗方法主要包括手术切除、放疗与化疗。化疗已经成为晚期患者的首要治疗方法，但肿瘤细胞对化疗的耐药性极大地降低了临床治疗效果^[3]。因此，研究宫颈癌细胞的化疗耐药形成机制具有重要意义。研究发现，前列腺癌相关转录本1(prostate cancer-related transcript 1, PCAT-1)是一种在前列腺癌中高表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，具有促进肿瘤发生与进展的功能^[4]。另有研究表明，PCAT-1在头颈部鳞状细胞癌中表达上调，并促进细胞增殖与抑制细胞凋亡^[5]。此外，Ma等^[6]研究发现干扰PCAT-1表达显著降低宫颈癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。目前，尚无研究报道PCAT-1在宫颈癌细胞顺铂(DDP)耐药中的生物学作用及潜在的调控机制。本研究拟在人宫颈癌DDP耐药细胞株(HeLa/DDP与SiHa/DDP)中干扰与过表达PCAT-1，观察细胞生存能力及细胞周期的变化，并检测信号转导子与转录激活子3(signal transducer and transcriptional activator 3, STAT3)与磷酸酶张力蛋白同源物(phosphatase tensin homolog, PTEN)蛋白表达水平的变化，以期阐明宫颈癌细胞DDP耐药机制。

1   材料与方法

1.1   细胞培养

人宫颈癌细胞株HeLa与SiHa、HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。所有细胞采用含10% FBS的RPMI 1640培养基、37℃含5% CO₂的培养箱培养。

1.2   细胞转染

pcDNA3.1载体、pcDNA3.1-PCAT-1载体、PCAT-1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)(si-PCAT-1-1#与si-PCAT-1-2#)和对应的阴性对照siRNA(si-control-1#与si-control-2#)购自中国上海GenePharma公司。细胞干扰实验分为空白对照组、阴性对照siRNA组与PCAT-1 siRNA组。细胞过表达实验分为空白对照组、pcDNA3.1载体组与pcDNA3.1-PCAT-1载体组。当HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞融合度约80%时，利用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，美国)转染适量的载体或寡核苷酸片段至HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞。48 h后，收集细胞并检测PCAT-1表达。

1.3   荧光定量PCR实验

利用TRIzol试剂(Invitrogen, 美国)提取细胞中的总RNA。利用PrimeScript™RT试剂盒(TaKaRa, 日本)合成cDNA。然后在ABI 7300 HT检测系统(Biosystems, 美国)上使用SYBR-Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒(Takara, 日本)进行荧光定量PCR实验。条件为：95℃持续20 s，随后进行40个如下循环：94℃持续15 s，58℃持续30 s，72℃持续30 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因校正目的基因PCAT-1的表达。实验设计3个复孔，并重复3次。引物序列如下：PCAT-1正向：5'-TTGTGGAAGCCCCGCAAGGCC-3'，反向：5'-TGTGGGGCCTGCACTGGCAC-3'; GAPDH正向：5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'，反向：5'-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3'。

1.4   CCK-8检测

将转染后的HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞按5 000个/孔的密度接种到96孔板中。培养24 h后，分别将0、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00、30.00和100.00 μg/ml DDP加入到细胞中，37℃下孵育48 h，CCK-8测定评估细胞生存能力。随后添加12 μl CCK-8溶液至每孔，37℃下孵育4 h，采用ELx800分光光度计(BioTek Instruments, 美国)测量各孔在490 nm处的吸光度。DDP半数抑制浓度(IC₅₀)定义为抑制50%细胞生存能力所需的DDP浓度。

1.5   流式细胞术检测

HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞转染48 h后，通过胰蛋白酶消化收集细胞，PBS缓冲液洗涤两次，4℃下70%乙醇固定过夜。再次PBS洗涤，室温，50 μg/ml碘化丙锭染色细胞12 min。荧光激活细胞分选法(BD Biosciences，美国)测量细胞周期，ModFit软件(Bio-Rad Laboratories，美国)分析G₀-G₁、S及G₂-M期细胞比例。

1.6   蛋白质印迹法检测

收集转染48 h细胞并使用RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技术，中国)提取总蛋白。12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(碧云天生物技术，中国)分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜(Millpore，美国)上，常温下5%脱脂牛奶中封闭2 h，随后将膜与特异性一抗(STAT3与PTEN)在4℃下孵育过夜，TBST缓冲液(碧云天生物技术，中国)洗涤3次，并在室温下与相应的二抗孵育1 h。所有一抗与二抗均购自美国Abcam公司。利用增强的化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)进行显色。以GAPDH为内参蛋白，并利用Tanon 3500/3500R凝胶成像系统(Tanon Science and Technology, 美国)校正STAT3与PTEN蛋白表达水平。

1.7   统计学方法

所有实验独立重复三次。使用SPSS 23.0软件进行统计学分析。实验结果表示为平均值±标准差。两组间比较使用t检验，三组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   HeLa、SiHa、HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中DDP IC₅₀值

HeLa/DDP和HeLa细胞中DDP IC₅₀分别为(27.46±3.97)和(6.12±1.50)μg/ml，差异有统计学意义(P < 0.001)，见图 1A。HeLa/DDP对HeLa的DDP耐药指数为4.49。SiHa/DDP和SiHa细胞中DDP的IC₅₀分别为(33.05±4.21)和(4.81±1.77)μg/ml，差异有统计学意义(P < 0.001)，见图 1B。SiHa/DDP对SiHa的DDP耐药指数为6.87。

图  1  HeLa与HeLa/DDP细胞(A)、SiHa与SiHa/DDP细胞(B)中DDP IC₅₀值

Figure  1  DDP IC₅₀ in HeLa and HeLa/DDP cells(A), SiHa and SiHa/DDP cells(B)

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2.2   PCAT-1在HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中表达上调

与HeLa细胞相比，HeLa/DDP细胞中PCAT-1表达水平显著上调(P=0.032)。与SiHa细胞相比，SiHa/DDP细胞中PCAT-1表达水平显著上调(P=0.009)，见图 2。

图  2  PCAT-1在HeLa与HeLa/DDP细胞、SiHa与SiHa/DDP细胞中的表达

Figure  2  PCAT-1 expression in HeLa and HeLa/DDP cells, SiHa and SiHa/DDP cells

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2.3   HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中过表达与干扰PCAT-1

与空白对照组及pcDNA3.1载体组相比，pcDNA3.1-PCAT-1载体组HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中内源性PCAT-1表达水平显著升高(均P < 0.001)，见图 3A。与空白对照组及si-control-1#组相比，si-PCAT-1-1#组HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中内源性PCAT-1表达水平显著降低(P=0.014, P=0.020)，见图 3B。与空白对照组及si-control-2#组相比，si-PCAT-1-2#组HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中内源性PCAT-1表达水平显著降低(P=0.046, P=0.021)，见图 3C。因为si-PCAT-1-1#的干扰效率高于si-PCAT-1-2#，因此选择si-PCAT-1-1#进行后续细胞功能实验。

图  3  HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中过表达(A)与干扰(B, C)PCAT-1表达

Figure  3  PCAT-1 overexpression(A) and silencing(B, C) in HeLa/DDP and SiHa/DDP cells

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2.4   过表达与干扰PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀的影响

空白对照组与pcDNA3.1载体组HeLa/DDP细胞DDP IC₅₀分别为(27.05±4.69)与(27.23±5.21)μg/ml，而pcDNA3.1-PCAT-1载体组HeLa/DDP细胞DDP IC₅₀为(34.88±6.16)μg/ml，差异有统计学意义(P=0.037)，见图 4A。HeLa/DDP细胞中pcDNA3.1-PCAT-1载体组对空白对照组与pcDNA3.1载体组的DDP耐药指数分别为1.29与1.28。空白对照组与pcDNA3.1载体组SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀分别为(32.65±6.11)与(31.94±6.48)μg/ml，而pcDNA3.1-PCAT-1载体组SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀为(47.03±8.54)μg/ml，差异有统计学意义(P=0.016)，见图 4B。SiHa/DDP细胞中pcDNA3.1-PCAT-1载体组对空白对照组与pcDNA3.1载体组的DDP耐药指数分别为1.44与1.47。空白对照组与si-control-1#组HeLa/DDP细胞DDP IC₅₀分别为(28.42±4.20)与(27.75±5.08)μg/ml，而si-PCAT-1-1#组HeLa/DDP细胞DDP IC₅₀为(21.29±4.47)μg/ml，差异有统计学意义(P=0.041)，见图 4C。HeLa/DDP细胞中si-PCAT-1-1#组对空白对照组与si-control-1#组的DDP耐药指数分别为0.75与0.77。空白对照组与si-control-1#组SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀分别为(33.60±5.86)与(33.79±6.11)μg/ml，而si-PCAT-1-1#组SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀为(20.03±3.78) μg/ml，差异有统计学意义(P=0.025)，见图 4D。SiHa/DDP细胞中si-PCAT-1-1组对空白对照组与si-control-1#组的DDP耐药指数分别为0.60与0.59。

图  4  过表达(A, B)与干扰(C, D)PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞DDP IC₅₀的影响

Figure  4  Effect of PCAT-1 overexpression(A, B) and silencing(C, D) on DDP IC₅₀ of HeLa/DDP and SiHa/DDP cells

1: Blank control; 2: pcDNA3.1 vector; 3: pcDNA3.1-PCAT-1 vector; 4: Blank control; 5: si-control-1#; 6: si-PCAT-1-1#.

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2.5   过表达与干扰PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞周期的影响

与空白对照组及pcDNA3.1载体组相比，pcDNA3.1-PCAT-1载体组HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞周期中S期比例升高，而G₀-G₁与G₂-M期比例降低(P=0.035, P=0.040)，见图 5A。与空白对照组及si-control-1#组相比，si-PCAT-1-1#组HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞周期中S期比例降低，而G₀-G₁与G₂-M期比例升高(P=0.029, P=0.013)，见图 5B。

图  5  过表达(A)与干扰(B)PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞周期的影响

Figure  5  Effect of PCAT-1 overexpression(A) and silencing (B) on cell cycle of HeLa/DDP and SiHa/DDP cells

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2.6   过表达与干扰PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中STAT3与PTEN蛋白表达的影响

与空白对照组及pcDNA3.1载体组相比，pcDNA3.1-PCAT-1载体组HeLa/DDP细胞中STAT3蛋白表达显著升高(P < 0.001)，而SiHa/DDP细胞中PTEN蛋白表达显著降低(P < 0.001)，见图 6A。与空白对照组及si-control-1#组相比，si-PCAT-1-1#组HeLa/DDP细胞中STAT3蛋白表达显著降低(P < 0.001)，而SiHa/DDP细胞中PTEN蛋白表达显著升高(P < 0.001)，见图 6B。

图  6  过表达(A)与干扰(B)PCAT-1对HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中STAT3与PTEN蛋白表达的影响

Figure  6  Effect of PCAT-1 overexpression(A) and silencing(B) on protein expression of STAT3 and PTEN in HeLa/DDP and SiHa/DDP cells

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3   讨论

LncRNAs是一类长度大于200个核苷酸、无蛋白质编码潜能，但在人类各种疾病中具有多种调控作用的RNA分子^[7]。研究发现，lncRNAs参与多种病理生理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和耐药等^[8-9]。当前，肿瘤细胞对化疗药物的耐药性严重降低宫颈癌患者的临床疗效。因此，探索宫颈癌细胞的耐药形成机制十分必要。目前已有报道阐明了一些lncRNAs在包括宫颈癌在内的多种肿瘤对DDP耐药中具有重要的调控作用。沉默HOX转录本反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)通过降低DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)和DNA甲基转移酶-3β(DNA methyltransferase 3β, DNMT3β)表达诱导同源盒蛋白A1甲基化失活，从而增加非小细胞肺癌细胞对DDP的敏感度^[10]。生长停滞特异性转录本5(growth arrest specific 5, GAS5)通过调控E2F4-PARP1-MAPK信号通路增加上皮卵巢癌细胞对DDP的敏感度^[11]。小核仁RNA宿主基因5(small nucleolar RNA host gene 5, SNHG5)通过调节细胞凋亡相关基因和药物耐药相关基因降低胃癌细胞对DDP的敏感度^[12]。Wen等^[13]研究报道GAS5通过调节丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt的磷酸化来影响宫颈癌对DDP的敏感度。此外，癌易感性候选基因2(cancer susceptibility 2, CASC2)通过吸附miR-21上调PTEN在宫颈癌对DDP的敏感度调控中亦起重要作用^[14]。因此，深入研究lncRNAs在宫颈癌DDP耐药中的作用机制将为该病的治疗提供新的思路与靶点。

PCAT-1定位于人染色体8q24.21区域，由两个外显子组成，转录本(NR_045262.2)全长为1992个核苷酸。据报道，PCAT-1在多种肿瘤组织异常表达，并与细胞生长、转移及耐药密切相关^[5-6]。然而，PCAT-1在宫颈癌细胞DDP耐药中的作用机制仍不清楚。本研究发现PCAT-1在HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中表达上调，过表达PCAT-1可降低HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞对DDP的敏感度，升高细胞周期中S期比例，并降低G₀-G₁与G₂-M期比例; 而干扰PCAT-1可致相反结果。食管癌细胞中，干扰PCAT-1表达提高细胞对DDP的敏感度，并抑制体内肿瘤生长^[15]。结肠癌中，沉默PCAT-1通过下调癌基因c-Myc表达抑制细胞迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，并增强细胞对5-氟尿嘧啶的敏感度^[16]。此外，骨髓瘤中，干扰PCAT-1通过调控p38和JNK/MAPK信号通路抑制细胞生长并增加细胞对硼替佐米的敏感度^[17]。上述结果表明，高表达PCAT-1促进宫颈癌细胞对DDP的耐药性，而靶向沉默PCAT-1逆转细胞对DDP的耐药性将有助于改善宫颈癌的临床疗效。

研究发现，STAT3是一个特异性转录因子，已被证实通过调控B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)表达来调节细胞增殖与凋亡，从而影响肿瘤发生和耐药性^[18]。另一项研究发现，在宫颈癌细胞中采用siRNA抑制STAT3表达导致细胞凋亡升高并提高细胞对DDP敏感度^[19]。PTEN是一种关键的肿瘤抑制因子，在细胞增殖、迁移和自我更新中起关键作用^[20]。PTEN异常表达与多种肿瘤细胞的耐药性密切相关^[21]。最近，Du等^[22]研究报告miR-21抑制剂通过调节PTEN抑制宫颈癌细胞增殖和集落形成，并提高细胞对紫杉醇的敏感度。本研究验证了STAT3与PTEN在宫颈癌细胞DDP耐药中的关键作用，更反映了PCAT-1通过上调STAT3与下调PTEN表达降低HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞对DDP的敏感度。

综上所述，本研究发现PCAT-1在HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中表达上调并降低细胞对DDP的敏感度，其机制可能与调控STAT3与PTEN表达有关。下一步工作计划将在小鼠模型中验证该结论。