0   引言

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤之一，2022年癌症统计数据显示，全球范围内肝癌是仅次于肺癌和结直肠癌的第三大癌症相关死亡原因^[1]。肝癌的发生与许多因素相关，比如病毒感染、肥胖和饮酒等^[2]。肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）与肿瘤的发生和转移有着密切的关系，肿瘤恶性细胞与免疫细胞和间质细胞相互作用，从而影响肿瘤免疫治疗的效果^[3]。肿瘤微环境中存在复杂多样的免疫细胞，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是其中一个重要的亚群^[4]，肿瘤细胞可以介导TAMs重塑，通过分泌不同功能的细胞因子发挥抗肿瘤或者促肿瘤的免疫功能，影响肿瘤的恶性进程^[5]。因此探究TAMs的调控机制对于提出肿瘤治疗新策略意义重大^[6]。

穹窿主体蛋白（Major vault protein，MVP），也称为肺耐药相关蛋白，是穹窿细胞核糖核蛋白颗粒的主要成分^[7]，其最早作为肿瘤多药耐药相关蛋白被发现^[8]。MVP是一种丰富的蛋白质，其表达广泛，可通过影响信号转导以及免疫反应等影响肿瘤的发生发展^[9]。目前巨噬细胞中MVP对肝癌发生发展的作用机制还不清楚，因此，本研究构建了巨噬细胞特异性缺失MVP的小鼠，探讨巨噬细胞中MVP在肝癌发生发展中的作用，为肝癌的临床治疗提供新的思路与理论基础。

1   材料与方法

1.1   实验材料与仪器

1.1.1   组织样本

收集在南京大学医学院附属鼓楼医院手术并经病理诊断的6例肝癌患者的肝癌组织及癌旁正常组织。本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（批准文号：2023-016-02），所有患者及其家属知情并签署同意书。

1.1.2   细胞

肝癌细胞系Hepa1-6购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）细胞库。所有细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）以及1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，放置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

1.1.3   动物

建立巨噬细胞MVP缺陷的小鼠（MVP ^loxp/loxp Lyz2^cre）。MVP ^loxp/loxp小鼠购自上海南方模式生物中心，通过在MVP基因外显子2-3两侧分别插入loxP位点构建。将MVP ^loxp/loxp小鼠与表达溶菌酶2（Lyz2）启动子的C57BL/6小鼠交配，获得在巨噬细胞中敲除MVP基因的小鼠。

1.1.4   试剂

DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素（南京维森特生物技术有限公司），PBS、胰蛋白酶、通用型组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司），巨噬细胞集落刺激因子M-CSF（武汉爱博泰克生物科技有限公司），Transwell小室（Corning公司，美国），结晶紫染色液、β-actin、HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗（上海碧云天生物公司，中国），RNA提取试剂盒、PCR反转录试剂盒、PCR荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，中国），MVP抗体（Santa Cruz公司，美国），CD8⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL公司，加拿大），STAT1、pSTAT1抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），特超敏ECL化学发光底物（Biosharp公司），多重荧光染色试剂盒（北京佰诺全景生物技术有限公司，中国），流式细胞术抗体（BioLegend公司，美国），酶联免疫吸附实验试剂盒（上海将来生物公司，中国）。

1.2   单细胞RNA-Seq数据处理

从GEO数据库下载得到scRNA-Seq测序的barcodes、feature以及matrix文件，GEO编号为GSE189903。接下来使用Seurat（4.4.0）依次对每个样本的scRNA-Seq测序数据进行处理。

1.3   实验方法

1.3.1   小鼠基因型鉴定

剪下小鼠尾巴的一部分组织放入EP管，加入50 μl鼠尾裂解液，然后按1∶50的比例加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。第二天85℃水浴1 h，得到的产物进行PCR扩增。MVP正向引物：5’-CACAGTGCACATAAACTTATGCAA-3’，反向引物：5’-TGATGTTCCAAAGGAGACAGTAAA-3’；Lyz2引物：5’-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3’，5’-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3’，5’-TTACAGTCGGCCAGGCTGAC-3’。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增产物长度判断基因型。

1.3.2   小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDMs）提取

将小鼠处死后取出股骨和胫骨，去除周围结缔组织，用剪刀修剪两端后从一端冲出骨髓中的细胞，用网筛过滤收集到离心管后离心，加红细胞裂解液静置5 min，离心后去除上清，剩余骨髓细胞在添加了细胞因子M-CSF的含有2%双抗的DMEM培养基中分化7天。

1.3.3   小鼠腹腔巨噬细胞（Peritoneal macrophages，PMs）提取

将小鼠处死后，固定四肢，用注射器吸取10 ml无菌PBS注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，使液体在腹腔内充分流动。吸出腹腔内的PBS收集到离心管，离心去除上清，用DMEM培养基重悬接种，3~4 h后贴壁细胞即为巨噬细胞。

1.3.4   Western blot实验

收集并裂解细胞获取总蛋白并定量，以30 μg蛋白上样量进行实验。蛋白样品在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后加入相应一抗4℃孵育过夜，第2天用相应的HRP偶联二抗室温孵育1 h，洗膜后用ECL化学发光试剂显影成像。

1.3.5   qPCR实验

使用RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，测定浓度。反转录合成cDNA，程序为50℃ 15 min，85℃ 5 s。随后进行qRT-PCR反应，扩增程序为95℃ 3 min，95℃ 15 s；60℃ 15 s，72℃ 60 s，72℃ 5 min，循环35次。用2^−ΔΔCt法计算目的基因的表达量。CXCL9正向引物：5’-GCAGTGTGGAGTTCGAGGAA-3’，反向引物：5’-AGTCCGGATCTAGGCAGGTT-3’；CXCL10正向引物：5’-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3’，反向引物：5’-TCCCTATGGCCCTCATTCTCA-3’。

1.3.6   克隆形成实验

收集培养的BMDMs以及PMs上清液，用0.22 μm滤网进行过滤，与DMEM以1∶4的比例混合制备成条件培养基对Hepa1-6肿瘤细胞进行培养。

1.3.7   Transwell细胞迁移实验

将细胞消化计数后在下室种入巨噬细胞，在上室种入肿瘤细胞Hepa1-6，24 h后取出小室，多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，用棉签擦去上层未迁移的细胞，光学显微镜下观察。

1.3.8   皮下移植瘤模型

选用5~6周龄C57BL/6雄性小鼠，将培养的Hepa1-6和B16F10细胞消化，用PBS重悬为5×10⁶个细胞/毫升的悬液，100 μl注射至小鼠右侧背部皮下，观察并记录移植瘤的生长情况，体积通过游标卡尺测量两个垂直直径来评估，并使用公式（长径×短径²×1/2）计算。测量结束后处死小鼠，切除肿瘤，称重，拍照。

1.3.9   诱发型肝癌动物模型

将二乙基亚硝胺（DEN）溶解在0.9%氯化钠溶液中，按照25 mg/kg的剂量注射到2周龄C57BL/6小鼠腹腔。6周之后，腹膜内按2 ml/kg的剂量注射四氯化碳（CCl₄），每周两次，持续12周。处死小鼠，取出肝脏称重，并观察肿瘤数量。

1.3.10   多重荧光免疫组织化学

将移植瘤组织固定在多聚甲醛中，并将石蜡包埋的组织切成4 μm的切片。65℃烤片2 h。二甲苯脱蜡2次，每次15 min，然后依次放入无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中浸洗2 min，纯净水浸洗切片后将切片浸入97℃抗原修复液中25 min，冷却至室温后用TBST洗涤切片3 次。在组织上滴加封闭液，室温孵育15 min。去封闭液后滴加一抗浸没组织， 4℃孵育过夜。复温后，TBST洗涤3次，滴加HRP标记鼠兔通用型二抗，孵育30 min后，TBST洗涤3次。滴加TSA荧光染料工作液，孵育15 min后TBST洗涤3次。循环部分步骤对下一个靶标进行染色。最后滴加DAPI工作液浸没组织5 min，TBST洗涤后滴加封片剂，指甲油封边。对染色后的组织切片在荧光成像设备中采集图像。

1.3.11   CD8⁺ T细胞分离

取小鼠脾脏，放入70 μm滤网研磨，加入PBS冲洗后离心，在样本中加入FcR阻断剂并转入流式管中，加入分选抗体混合物，混匀后孵育10 min，涡旋振荡磁珠，将磁珠加到样本中混匀并孵育2.5 min，添加缓冲液定容至2.5 ml，将试管放入磁极中并孵育，富集的细胞悬液倒入新试管中得到CD8⁺ T细胞。

1.3.12   流式细胞术

制备所需要细胞的单细胞悬液，每管保持数量级在1×10⁶个。加入FcR阻断剂吹打混匀，冰上孵育10 min。加入对应的流式抗体混匀后放于冰上，避光孵育30 min。每管加入1 ml PBS重悬细胞，500 g离心5 min，吸去上清液。加入500 μl PBS重悬细胞并转移到流式管中。用流式细胞仪吸取样本进行检测和分析，并用FlowJo分析软件分析数据。

1.3.13   酶联免疫吸附ELISA实验

收取细胞上清液样本。将标准品与样本分别加入检测孔，37℃孵育1 h。加入100 μl酶标抗体37℃孵育1 h后洗涤。加入100 μl底物，37℃避光孵育30 min。加入50 μl终止液，随后立即于450 nm波长处读取吸光度值。

1.4   统计学方法

使用GraphPad Prism 9软件对数据进行统计学分析。组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   MVP在肿瘤相关巨噬细胞中的表达

我们从GEO数据库中下载了20例肝癌患者肿瘤样本的scRNA-seq数据。通过UAMP聚类分析分为6群，包括2 291个B细胞、1 459个癌症相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）、17 164个恶性细胞、19 587个T细胞、5 171个TAMs以及2 646个肿瘤相关内皮细胞，见图1A。进一步分析MVP在不同细胞中的表达，发现MVP在TAMs中的表达较高，仅次于恶性细胞，这表明巨噬细胞中的MVP可能在肝癌的进程中发挥作用，见图1B。进一步，对6例肝癌患者的肿瘤和癌旁正常组织进行多重荧光免疫组织化学染色，检测发现与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中CD68⁺巨噬细胞的MVP表达量显著降低（P<0.000 1），见图1C。

图  1  MVP在肿瘤相关巨噬细胞中表达下调

Figure  1  Expression of MVP was downregulated in tumor-associated macrophages

A: UMAP dimensionality reduction results of scRNA-seq data from adjacent normal tissues and HCC patients; B: expression of MVP in different cells; C: expression of MVP in macrophages from the tumor and adjacent tissue.

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2.2   构建巨噬细胞中MVP敲除的小鼠

通过Cre/LoxP重组酶系统，建立单核巨噬细胞中MVP特异性敲除小鼠模型。对小鼠DNA进行基因型鉴定，根据PCR扩增产物的电泳结果判断基因型，Lyz2^cre/−条带为700 bp和350 bp，Lyz2^−/−条带为350 bp，MVP^f/f条带为895 bp，见图2A。提取MVP^f/f Lyz2^−/−（MVP WT）和MVP^f/f Lyz2^cre/−（MVP KO）小鼠的BMDMs，进行Western blot检测，结果显示MVP KO小鼠BMDMs中MVP蛋白表达水平显著低于MVP WT小鼠，见图2B。我们成功构建了巨噬细胞中MVP条件性敲除小鼠。

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2.3   巨噬细胞MVP缺失促进肝癌细胞的增殖迁移

提取MVP WT和MVP KO小鼠的BMDMs和PMs，取上清液与DMEM培养基混合制成条件培养基（Conditioned medium, CM），用于培养Hepa1-6肝癌细胞。结果显示，相比MVP WT组，用MVP KO小鼠BMDMs收集的条件培养基培养Hepa1-6细胞后，细胞克隆形成数显著增多（P<0.01），见图3A；用PMs收集的条件培养基培养Hepa1-6细胞后也得到相似结果（P<0.001），见图3B。Transwell细胞迁移实验也发现，巨噬细胞MVP KO的条件性培养基显著促进了Hepa1-6细胞的迁移（均P<0.01），见图3C、D。

图  3  巨噬细胞MVP缺失促进肝癌细胞的增殖和迁移

Figure  3  MVP deficiency in macrophages increased the proliferation and migration abilities of liver cancer cells

A-B: effect of conditional medium from MVP-deficient bone marrow-derived macrophages and peritoneal macrophages on colony formation of Hepa1-6 cells; C-D: effect of conditional medium from MVP-deficient BMDMs and PMs on the migration of Hepa1-6 cells; CM: conditioned medium.

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2.4   巨噬细胞MVP缺失促进皮下移植瘤生长

皮下注射肝癌细胞Hepa1-6到MVP WT与MVP KO小鼠的后背部，观察肿瘤的生长。与MVP WT组小鼠相比，MVP KO组小鼠的肿瘤体积显著增大，瘤重也显著增加（均P<0.01），见图4。

图  4  巨噬细胞MVP缺失促进皮下移植瘤生长

Figure  4  MVP deficiency in macrophages promoted tumor growth in vivo

A: representative tumor morphology images of Hepa1-6 models; B-C: tumor volume and weight of Hepa1-6 models.

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2.5   巨噬细胞MVP缺失形成免疫抑制微环境

多重荧光免疫组织化学染色发现，相对于MVP WT小鼠，MVP KO组肿瘤中浸润的CD8⁺ T细胞数量明显减少。CD8⁺ T细胞是肿瘤中最重要的抗肿瘤效应细胞，CD8⁺ T细胞功能耗竭会降低其抗肿瘤效应^[10]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3）和PD-1是免疫检查点负性调控分子，二者都可通过抑制T细胞的活性发挥免疫抑制作用^[11]。我们还观察到，MVP KO组表达PD-1和TIM-3的耗竭型CD8⁺ T细胞的比例显著增加（均P<0.01），见图5A、B。表明巨噬细胞中MVP缺失介导肿瘤免疫抑制微环境形成，从而导致肿瘤生长加快。

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2.6   巨噬细胞MVP缺失促进原发性肝癌发生

我们利用MVP WT和MVP KO小鼠建立DEN/CCl₄诱导的小鼠肝癌模型。与MVP WT小鼠相比，MVP KO组小鼠的肿瘤重量与数目明显增加（均P<0.05），见图6A~C。对两组小鼠的肝脏进行HE染色以及多重荧光免疫组织化学检测，选取肿瘤部位进行分析，与MVP WT组相比，MVP KO组肿瘤中浸润的CD8⁺ T细胞明显减少（P<0.01），而耗竭型CD8⁺ T细胞显著增多（P<0.000 1），见图6D~F。

图  6  巨噬细胞MVP缺失促进原发性肝癌的发生

Figure  6  MVP deficiency in macrophages promoted primary liver carcinogenesis

A: schematic diagram of DEN/CCl₄-induced HCC animal model; B, C: representative liver morphology images and tumor weight and numbers of DEN/CCl₄ models; D-F: HE staining and multiple fluorescence immunohistochemical images of tumors from MVP WT and MVP KO mice. *: P<0.05; **: P<0.01; ****: P<0.0001.

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2.7   巨噬细胞MVP缺失的促肿瘤效应依赖CD8⁺ T细胞

将肝癌细胞Hepa1-6和BMDMs共培养，从小鼠脾脏中提取CD8⁺ T细胞，加入共培养体系检测肿瘤细胞的凋亡水平，结果显示，Hepa1-6细胞在与MVP WT或MVP KO小鼠提取的BMDMs单独培养时，肿瘤细胞凋亡水平没有显著差异。但是，CD8⁺ T细胞、Hepa1-6和MVP WT鼠中提取的BMDMs三者共培养后，Hepa1-6细胞凋亡显著增加，并且高于与MVP KO小鼠中提取的BMDMs共培养时Hepa1-6细胞的凋亡水平（均P<0.01），见图7。说明巨噬细胞MVP抑制肿瘤生长依赖于CD8⁺ T细胞。

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2.8   巨噬细胞MVP缺失减弱 CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫

将CD8⁺ T细胞与Hepa1-6及BMDMs共培养，发现MVP KO组中CD8⁺ T细胞的迁移比率显著少于MVP WT组（P<0.001），见图8A。此外，流式细胞术分析发现，相较于MVP WT组，与MVP KO组共培养的CD8⁺ T细胞的增殖活性（Ki-67）（P<0.001）和效应功能（Interferon-γ，IFN-γ）显著降低（P<0.05），见图8B~D。之前的结果显示MVP KO的小鼠肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润减少（见图5），而巨噬细胞可以分泌趋化因子CXCL9和CXCL10招募CD8⁺ T细胞至肿瘤部位介导抗肿瘤免疫反应^[12-13]。因此，提取MVP WT和MVP KO小鼠BMDMs进行qPCR检测验证，发现MVP KO小鼠BMDMs中的CXCL9和CXCL10表达下调（P<0.05，<0.001），见图8E。此外，收取细胞上清液进行ELISA实验，发现MVP KO小鼠BMDMs上清液中的CXCL9、CXCL10水平低于MVP WT小鼠BMDMs（均P<0.001），见图8F。已有研究报道，STAT1可调控CXCL9和CXCL10的表达^[14]。Western blot检测发现MVP KO小鼠BMDMs中的STAT1蛋白表达水平与MVP WT小鼠没有差异，而STAT1磷酸化水平显著降低，见图8G。说明巨噬细胞MVP缺失可能是通过抑制转录因子STAT1活性，导致CXCL9和CXCL10表达下降，从而抑制CD8⁺ T细胞向肿瘤细胞迁移，抑制CD8⁺ T细胞的抗肿瘤免疫反应。

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3   讨论

巨噬细胞是TME中除肿瘤细胞外数目最多的免疫细胞。肿瘤微环境中的巨噬细胞会被驯化为TAMs，促进肿瘤的生长、侵袭和转移^[15]。此外，巨噬细胞也可以发挥杀伤肿瘤细胞的功能，比如利用吞噬和细胞毒性发挥抗肿瘤作用^[16]。因此，研究肿瘤相关巨噬细胞影响肝癌发生发展的作用机制至关重要。本研究利用多例scRNA-seq 数据的分析以及临床组织样本的多重荧光免疫组织化学分析，发现MVP在巨噬细胞中高表达且在肿瘤相关巨噬细胞中表达降低，MVP可能与肝癌进程相关。

肿瘤相关巨噬细胞是TME中的关键细胞，它与TME中的各种免疫细胞和细胞因子之间的串扰起着不可替代的作用^[17]。TME的免疫成分在调节有效的抗肿瘤T细胞应答中发挥重要作用。在实体瘤中，TME中的免疫细胞通常包括抗原提呈细胞，其中肿瘤相关巨噬细胞往往是最丰富的。研究报道，肿瘤相关巨噬细胞的表型和功能是多样的，一方面分泌TGF-β、IL-10和精氨酸酶等，进一步加速TME的重塑，并分别通过多种机制促进肿瘤的生存、发展和转移^[18]。另一方面，它可以通过吞噬肿瘤细胞和招募细胞毒性T细胞而发挥抗肿瘤功能^[19]。CD8⁺ T细胞是抗肿瘤免疫反应的关键介质，是目前免疫治疗的主要靶点。与非浸润性肿瘤相比，肿瘤浸润CD8⁺ T细胞与改善预后和免疫检查点封锁相关^[10]。然而，这些CD8⁺ T细胞往往处于耗竭状态进而失去功能，主要表现为表达抑制性分子（包括PD-1、CTLA-4和TOX）而失去细胞毒性效应功能^[20]。本研究通过多重荧光免疫组织化学染色检测了巨噬细胞MVP对CD8⁺ T细胞浸润的影响，体外共培养证明巨噬细胞MVP缺失对肿瘤的促进作用依赖于CD8⁺ T细胞，并且发现巨噬细胞MVP缺失抑制CD8⁺ T细胞功能，介导免疫抑制肿瘤微环境的形成。有研究表明，TIM-3和PD-1的共表达与更严重的CD8⁺ T细胞衰竭有关，并与其增殖和分泌效应细胞因子相关联，如IFN-γ等^[11]。我们观察到巨噬细胞MVP缺失后CD8⁺ T细胞数量减少，而表达TIM-3和PD-1的CD8⁺ T细胞占比增多，CD8⁺ T细胞处于耗竭状态。同时，这种缺失也会减弱IFN-γ的分泌，削弱CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤功能。

随着对肿瘤免疫微环境研究的深入，特别是近年来单细胞测序技术的发展，研究人员逐渐认识到肿瘤相关巨噬细胞的组成和功能均存在异质性和多样性，这与肿瘤免疫治疗效果密切相关。CXCL9、CXCL10是促进免疫细胞招募到肿瘤的关键因素，其缺失会抑制表达CXCR3的CD8⁺T细胞从循环中招募到肿瘤部位^[21]，形成免疫抑制微环境。同时，IFN-γ是肿瘤微环境的主要调节因子，可以激活转录调节因子STAT1^[22]，因此，巨噬细胞MVP缺失会抑制CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ，进一步抑制STAT1的表达，减少CXCL9、CXCL10介导的CD8⁺T细胞浸润。促进这些趋化因子的表达可能在临床中提高免疫治疗的疗效，靶向它们可能具有药用潜力^[23]。有文献报道趋化因子CXCL9增强CD8⁺T细胞生成IFN-γ的能力^[24]。本研究发现TAMs中MVP缺失能抑制CD8⁺ T细胞功能，促进肝癌的发生发展，提示巨噬细胞中MVP表达可能作为评判肿瘤微环境中免疫状态的分子标志物，同时也为肝癌的免疫治疗提供新的靶点，激活TAMs中MVP的表达可能增强肝癌免疫治疗的临床疗效，为肝癌的防治提供了新策略。