0   引言

肺癌发病率和死亡率居高不下，其中肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）是肺癌中的常见病理亚型^[1]。LUSC患者早期临床症状不明显，大多数患者临床确诊时，已处于中晚期，患者预后、治疗效果不太理想，导致LUSC患者5年生存率很低^[2]。

研究发现长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）影响肺鳞癌细胞增殖、迁移和凋亡^[3]。Tsvetkov新发现了一种新的细胞死亡形式—铜死亡^[4]。铜死亡相关lncRNAs（cuproptosis related lncRNAs, CRLs）的研究成为新热点，越来越多的研究表明CRLs与癌症患者的预后密切相关^[5-6]。然而，CRLs与LUSC的进展是否有关尚不清楚，是否可以作为预测LUSC患者预后、选择免疫治疗和药物治疗的重要指标也尚不清楚。因此，本研究基于CRLs开发了一种新的LUSC患者预后模型，并进一步开展免疫相关功能分析、免疫检查点基因（immune checkpoint genes, ICGs）分析，为LUSC的预后和患者个体免疫化治疗选择提供科学依据。

1   资料与方法

1.1   数据收集及预处理

从GTEx数据库（https://www.gtexportal.org/）下载正常肺组织的RNA-sep表达矩阵，共获取288例。从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载LUSC的RNA-sep表达矩阵，其中LUSC组织502例、对照组49例，并对数据进行批量归一化。同时下载了TCGA-LUSC患者临床数据，排除临床资料缺失、生存期 < 30天、RNA-seq表达矩阵不完整的患者，最终共纳入451例LUSC患者。通过查阅文献，检索到19个铜死亡基因^[7]，49个免疫检查点基因^[8]。

1.2   差异表达CRLs的鉴定

利用“limma”R包对铜死亡基因与TCGA-LUSC组织中lncRNAs进行共表达分析，以|R| > 0.3且P < 0.001为筛选标准，鉴定出CRLs^[9]。结合GTEx，鉴定差异表达的CRLs，设置筛选条件为|logFC| > 1且Adjusted P < 0.05，并利用“pheatmap”R包绘制火山图进行展示^[10]。

1.3   基于CRLs的LUSC预后风险模型的建立与评估

将以上差异表达的CRLs表达量与生存状态、生存时间合并。通过单因素Cox回归分析、Lasso回归分析以及多因素Cox回归分析，筛选与LUSC预后相关的CRLs以及计算它们的回归系数，建立LUSC预后风险评分模型：Risk score=（lncRNA1表达量*系数）+（lncRNA2表达量*系数）+...+（lncRNAn表达量*系数）。

根据风险评分的中位值，将LUSC患者重新划分为高风险组和低风险组，并应用“survminer”R包对高、低风险组的总生存期（OS）进行生存分析。绘制C-index曲线以及ROC曲线下面积（AUC）评估风险评分模型预测LUSC患者预后能力。

1.4   列线图预后模型的建立及评估

将临床特征及风险评分一起进行单因素及多因素Cox回归分析，以确定独立的预后特征。使用“rms”R包建立列线图模型。通过计算AUC值以及绘制校准曲线、决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）评估列线图模型的预测效能。

1.5   风险评分在预测患者免疫治疗中的作用

本研究利用单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）对TCGA-LUSC中每个样本进行免疫相关功能评分^[11]。探究免疫相关功能、ICGs在高、低风险组之间的差异情况^[12]。

1.6   统计学方法

本研究应用R软件（https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/，版本4.1.1）和Perl软件（https://www.perl.org，版本5.30）进行数据整理及分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   筛选差异表达的CRLs

从TCGA-LUSC资料库中提取了19个铜死亡基因以及16 882个lncRNAs的表达量。进行共表达分析以鉴定CRLs。根据设置Pearson的相关标准（|R| > 0.3且P < 0.001）识别出1 445个CRLs。

利用韦恩图的方式将TCGA数据库中1 455个CRLs与GTEx数据库中相关基因取交集，共获得1 204个CRLs，见图 1A，根据|logFC|＞1且P < 0.05，发现LUSC与对照组之间有721个CRLs的表达量存在显著差异，其中382个CRLs上调，339个CRLs下调，结果以火山图形式进行展现，见图 1B。

图  1  筛选LUSC中差异表达的CRLs

Figure  1  Screening for differentially expressed CRLs in LUSC

LUSC: lung squamous cell carcinoma; A: Wayne plot (intersection of cuproptosis-related lncRNAs in TCGA-LUSC and related genes in GTEx); B: volcano map (differential expression of lncRNAs between LUSC tissue and control group).

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2.2   CRLs预后模型的构建

将以上筛选的721个CRLs，通过单因素Cox回归分析从中获得42个CRLs与LUSC患者的OS显著相关，见图 2A。Lasso回归分析对变量进行降维，筛选出27个最具代表性的CRLs，见图 2B、C。对27个CRLs进行多因素Cox回归分析，结果显示有9个CRLs是LUSC预后独立的lncRNA。其中BX546450.2、AP006545.1的风险比（HR） < 1；AP003071.4、AC092140.2、BLACE、AC007336.1、AC012676.4、LINC00229、AC060814.2的HR > 1，见图 2D。此外，我们利用桑基图展现铜死亡基因与这9个CRLs之间共表达关系，见图 2E。Risk score= [AP003071.4表达量*（0.582）]+[AC092140.2表达量*（0.474）]-[BX546450.2表达量*（0.246）]+[BLACE表达量*（0.115）]+[AC007336.1表达量*（0.833）]+[AC012676.4表达量*（0.896）]+[LINC00229表达量*（0.122）]-[AP006545.1表达量*（0.288）]+[AC060814.2表达量*（0.384）]。

图  2  基于CRLs的LUSC患者风险模型

Figure  2  Risk model based on CRLs for patients with LUSC

A: forest plot identifying 42 CRLs significantly associated with clinical outcomes by univariate Cox regression analysis; B: coefficient distribution of 27 OS-related CRLs selected by lasso regression; C: cross validation of optimal parameter λ for the selection process; D: forest plots showing nine independent prognostic CRLs through multivariate Cox regression analysis; E: Sangi diagram showing the co-expression relationship among cuproptosis genes, CRLs, and risk types.

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2.3   风险评分模型的预后价值

使用风险评分公式计算了451例LUSC患者的风险评分，取中位值，将所有LUSC患者划分为高风险组与低风险组。风险评分分布的风险曲线、散点图显示患者随着风险评分增加，患者死亡率升高，见图 3A。Kaplan-Meier生存曲线比较两组之间的OS，发现LUSC患者高风险组患者的OS低于低风险组（P < 0.001），见图 3B。绘制C-index曲线，发现风险评分的C-index依次高于年龄、性别、吸烟史、种族、原发肿瘤位置、放疗史、TNM分期，见图 3C。计算风险评分及临床特征预测LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值，结果显示风险评分预测LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分别为0.710、0.718、0.743，均大于其他临床特征，见图 3D~F。

图  3  风险评分模型的预后价值

Figure  3  Prognostic value of the risk score model

A: patients with LUSC were ranked according to risk score, and correlation between survival status and risk score was indicated using scatter plots; B: Kaplan–Meier survival curves for OS of patients with LUSC in high-and low-risk groups; C: C-index curve for assessment of risk score characteristics and clinical features independently to determine the OS probability of the patients at each time point; D-F: AUC values of ROC curves comparing the accuracy of risk scores and other clinical features in predicting the 1-, 3-, and 5-year survival rates of the patients.

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2.4   确定独立预后特征

为了确定独立预后特征，将年龄、性别、种族、肿瘤原发位置、TNM分期、吸烟史、放疗史以及风险评分一起进行单因素及多因素Cox回归分析，结果显示年龄：≥65岁（HR=1.48, 95%CI: 1.07~2.05, P=0.018）、性别：女（HR=0.61, 95%CI: 0.43~0.87, P=0.006、肿瘤原发部位：肺中叶（HR=3.32, 95%CI: 1.69~6.52, P < 0.001）和肺下叶（HR=0.72, 95%CI: 0.52~1.00, P=0.048）、TNM分期：Ⅲ期（HR=1.95, 95%CI: 1.33~2.85, P < 0.001）以及风险评分特征：高风险（HR=3.04, 95%CI: 2.22~4.15, P < 0.001）是LUSC患者预后影响因素，见图 4。

图  4  LUSC预后的多因素Cox回归分析结果森林图

Figure  4  Forest map of multivariate Cox regression analysis of LUSC prognosis

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2.5   构建及评估列线图预测模型

基于性别、年龄、肿瘤原发部位、TNM分期和风险评分构建LUSC患者预测预后列线图模型，见图 5A。列线图模型预测LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分别为0.733、0.763、0.773。与风险评分模型相比，列线图模型进一步增强了预测能力，见图 5B。校准曲线显示患者实际1、3、5年生存率与预测患者1、3、5年生存率一致性较高，见图 5C，表明模型校准度强。DCA显示列线图模型的临床预测效能较好，见图 5D。

图  5  构建及评估预测LUSC患者预后的列线图模型

Figure  5  Construction and evaluation of the nomogram model to predict the prognosis of patients with LUSC

A: nomogram developed to predict prognosis based on age, gender, stage, primary tumor location, and risk score. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001; B: AUC values of the nomograms for predicting the 1-, 3-, and 5-year survival rates of patients with LUSC; C: calibration curves of the nomograms; D: DCA for assessment of the clinical efficacy of the model.

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2.6   风险评分与免疫特征的相关性分析

为了进一步探索LUSC不同风险人群与抗肿瘤免疫之间的关系，本研究使用ssGSEA分析了免疫相关功能与LUSC高风险、低风险人群之间的相关性。结果显示抑制肿瘤抑制基因、细胞因子受体、细胞溶解活性、炎性反应以及T细胞共同刺激等免疫功能存在显著差异，见图 6A。细胞因子受体、细胞溶解活性、炎性反应以及T细胞共同刺激在高风险组中更活跃。本研究还比较了高风险和低风险组中免疫检查点基因的表达水平，结果显示49个ICGs中有19个ICGs在高低危险组中存在差异，其中17个ICGs（CD40、CD86、CD160、CD274、TNFSF18、TNFRSF8、CD244、TNFSF9、VTCN1、HAVCR2、ICOSLG、ICOS、LGALS9、CD28、TNFRSF18、IDO2、TNFRSF25）在低风险组中的表达高于高风险组，有2个ICGs（TNFRSF9、KIR3DL1）在高风险组的表达高于低风险组（P < 0.05），见图 6B。

图  6  风险评分与免疫特征的相关性分析

Figure  6  Correlation analysis of risk score and immune signature

ns: not statistically significant; *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; A: comparison of immune-related functions between the high-and low-risk groups; B: comparison of the expression of immune checkpoint genes between the two groups.

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3   讨论

LINC00482主要被报道于其他部位的肿瘤，如膀胱细胞癌和肝细胞癌^[13-14]。LINC00482在膀胱癌细胞和组织中高表达，LINC00482可作为致癌基因结合转录因子FOXA1发挥作用，LINC00482通过FOXA1在膀胱细胞癌中下调MMP-15的表达量，抑制膀胱肿瘤相关炎性反应和血管生成。本研究也发现LINC00482是LUSC的危险因素，对LUSC预后不利。本研究对lncRNAs在肿瘤进展过程中的作用知之甚少。提示研究这些未知的lncRNAs，可以确定预测LUSC预后和治疗的新方案。

以往研究基于29个铁死亡相关lncRNAs开发的风险评分模型预测LUSC患者1、3年生存率的AUC值分别是0.658、0.693^[15]。而本研究基于9个CRLs开发的风险评分模型相对较优，预测LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分别是0.710、0.718和0.743。此外，风险评分能够准确区分LUSC患者的高低风险组，并且高风险患者的OS低于低风险患者。

本研究中，多因素Cox回归分析发现年龄、性别、肿瘤原发部位、TNM分期与LUSC患者预后密切相关。患者年龄越大对预后越不利，与Liu等^[16]研究结果一致。以往研究表明，与男性相比，女性患者癌细胞发生转移频率更低^[17]。因此，男性患者的生存结果比女性差，与本研究结果一致。国外学者研究报道，由于肺中叶解剖结构独特，它被肺上叶、肺下叶以及心包包围，不易于发现且临床症状轻，大多数患者确诊时已发生转移，与肺上叶患者相比，其预后差^[18]。此外，风险评分是LUSC预后的影响因素，且风险评分特征的C-index和AUC值均大于其他临床特征。综上所述，本研究基于9个CRLs开发的风险评分模型可以更准确的预测LUSC的预后情况。

癌细胞的进展与免疫抑制有关，癌细胞通过不同的机制逃避免疫系统监视，包括激活抑制抗肿瘤免疫反应的免疫功能和免疫检查点通路。ICGs在调节自身免疫反应性方面发挥着核心作用，成为肿瘤治疗重要手段^[19]。免疫功能分析显示，高风险组患者更多参与细胞因子受体、细胞溶解活性、炎性反应以及T细胞共同刺激等免疫功能。表明这些免疫功能在低风险组中受到抑制，需要激活它们，增强机体的抗肿瘤免疫功能，从而抵抗癌细胞的攻击，延长低风险组患者的生存时间^[10]。ICGs差异分析，发现只有TNFRSF9在高风险组中表达水平高于低风险组。TNFRSF9是一种T细胞共刺激受体，它对调节性T细胞、活化的自然杀伤T细胞和活化的NK细胞有作用，提示TNFRSF9抑制剂进入机体后，机体的T细胞可以识别癌细胞，通过免疫系统杀死癌细胞，改善高风险患者预后^[20-21]。总之，风险评分模型可以在一定程度上反映免疫治疗的效果和免疫应答率，从不同的角度为LUSC患者的免疫干预治疗提供新的见解。

本研究存在几处局限性。首先，研究数据是从国外公共据库（TCGA和GTEx）提取，缺乏临床样本对结果进行外部验证。其次，在以往研究中发现手术、化疗对LUSC患者预后也有显著影响，但国外数据库的临床信息中缺乏这些治疗方法。因此，有必要收集更多的LUSC临床样本，以及更全面的临床特征进行外部验证。

综上所述，本研究构建了一个基于9种CRLs的风险模型，在预测LUSC患者预后方面准确性高。同时，风险评分结合年龄、性别、TNM分期以及肿瘤原发位置构建的列线图模型，可以作为一种新颖的临床工具使用。本研究增加了免疫相关功能分析、ICGs分析，对LUSC的预后和患者个体免疫化治疗选择提供科学依据。