0   引言

胆囊癌（gallbladder cancer, GBC）是一种极具转移性的胆道恶性肿瘤，也是全球第五常见的消化道肿瘤^[1-2]。近年来，尽管高通量芯片发现了上千种lncRNAs在胆囊癌样本中呈差异表达^[3]，但仅有少数lncRNAs的功能得到了比较详细的阐明。胃癌增殖增强转录物1（gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1, GHET1）于2014年首次在胃癌研究中被发现具有促进细胞增殖的作用，随后证实其在膀胱癌、乳腺癌以及宫颈癌中也发挥促癌作用^[4]。miR-27b在多种肿瘤中低表达并发挥抑癌因子功能^[5]，经相关公共数据库与生物信息学分析，发现miR-27b可能受到GHET1的调控。有关GHET1与miR-27b在胆囊癌中的作用报道较少。鉴于此，本研究将明确GHET1对胆囊癌细胞生物学行为的影响及其对miR-27b的调控机制，以期为胆囊癌的诊疗提供一定的实验基础。

1   材料与方法

1.1   主要试剂

RNA提取试剂（Tiangen，北京），miRNA反转录试剂盒（Clontech，美国），普通反转录与实时荧光定量PCR试剂盒（Takara，日本），Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，美国），胎牛血清（FBS）（Cell-Box，香港），MTT（Beyotime Biotechnology，上海），Transwell小室和基质胶（Corning，美国），荧光素酶检测试剂盒（GeneCopoeia，美国），lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen，美国），si-NC载体、si-GHET1载体以及miR-27b抑制物（Bersinbio，广州），GHET1-wt和GHET1-mut报告载体（Ribobio，广州）。

1.2   临床标本

收集2016年1月—2019年12月在湖南省人民医院肝胆外科行手术治疗的50例胆囊癌患者的癌组织与癌旁组织。其中男21例，女29例，年龄39~77岁（55.18±11.69岁）。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他抗癌治疗。纳入标准：原发性胆囊癌患者，经影像学检查与病理检查确诊，并具有手术治疗指征。排除标准：其他类型胆道肿瘤患者，严重心、肝、肾功能衰竭患者，出血性疾病或凝血功能严重异常患者，精神障碍疾病患者，伴有其他手术禁忌证患者。收集的组织存入液氮中备用。所有患者均签署知情同意书。本研究通过湖南省人民医院医学研究伦理委员会审批（伦理号2019009）。

1.3   细胞培养

SGC-996细胞来自中国科学院上海研究所细胞培养库。采用DMEM培养基和10%FBS培养细胞，并加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素进行抑菌处理。细胞培养箱温度设定为37℃，含5%CO₂和95%空气。每隔两天更换一次培养基，并进行常规传代。待细胞状态到达对数生长期时，进行体外细胞实验。

1.4   实验分组和细胞转染

体外细胞实验分成对照组、GHET1干扰组、miR-27b干扰组以及GHET1+miR-27b干扰组，分别向SGC-996细胞中转染si-NC载体、si-GHET1载体、miR-27b抑制物以及si-GHET1载体+miR-27b抑制物。将SGC-996细胞均匀接种至6孔板，使每孔细胞数量约为5×10⁶个。上述各组细胞培养24 h后，采用lipofectamine 2000转染试剂分别瞬时转染2.5 μg si-NC载体、2.5 μg si-GHET1载体、200 nmol miR-27b抑制物、2.5 μg si-GHET1载体+200 nmol miR-27b抑制物。24 h后1 200 r/min离心5 min，收集各组细胞，检测转染效率。

1.5   实时荧光定量PCR

采用RNA提取试剂提取组织与细胞中的总RNA。分别采用miRNA反转录与普通反转录试剂盒合成针对miR-27b和GHET1的cDNA。随后以各自cDNA作为模版进行实时荧光定量PCR。扩增条件设为：95℃ 10 min，之后95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s、共40个循环，随后72℃ 5 min，最后4℃ 20 min。miR-27b引物：5’-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3’（正向），5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’（反向）。GHET1引物：5’-CTTGAGCCTCAGTTTCTCCATC-3’（正向），5’-CTTGCTAATTTGAGTTCCTCGT-3’（反向）。采用2^-ΔΔCt法，分别以U6和GAPDH为内参基因计算miR-27b和GHET1相对表达水平。

1.6   MTT法检测细胞增殖

将1.4方法中的细胞均匀接种至96孔板，使每孔细胞数量约为3×10³个。在0、12、24和48 h时间点向对应孔中加入13 μl MTT（浓度：5 mg/ml）。培养4 h后，再向对应孔中加入150 μl二甲基亚砜。室温低速摇晃15 min致结晶完全溶解。采用酶标仪测量各孔在450 nm处的吸光度（OD）值，比较各组细胞增殖情况。

1.7   Transwell试验检测细胞转移

利用基质胶均匀覆盖Transwell上室，并将1.4方法中的细胞均匀接种至上室，细胞数量约为5×10⁵个。下室中添加500 μl DMEM培养基+10%FBS充当引诱剂。48 h后使用无菌棉条轻轻擦掉上室中的细胞，将转移至下室中细胞用4%多聚甲醛室温固定15 min。随后采用0.1%结晶紫溶液室温染色10 min，并采用IX71倒置显微镜观察拍照，随机选择6处视野计算每个视野下转移细胞数。

1.8   流式细胞术检测细胞凋亡

将1.4方法中的细胞均匀接种至12孔板，使每孔细胞数量约为2.5×10⁶个。48 h后1 200 r/min离心5 min收集细胞，以冷PBS洗涤三次。采用适量结合液将细胞重新悬浮，使其密度为1×10⁶/ml。取1 ml细胞，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC室温避光染色30 min。再加入2 μl碘化丙啶（PI）室温避光染色20 min，采用流式细胞仪比较各组细胞凋亡率。

1.9   荧光素酶报告基因实验检测GHET1与miR-27b的结合位点情况

GHET1-wt报告载体（ACUGUGA）中包含miR-27b预测结合位点，而GHET1-mut报告载体中（将ACUGUGA突变成UGACACU）不含miR-27b预测结合位点。将SGC-996细胞均匀接种至24孔板，使每孔细胞数量约为4×10⁵个。培养24 h后，采用Lipofectamine 2000转染试剂瞬时共转染50 nmol miR-27b抑制物和0.8 μg GHET1-wt报告载体，0 nmol miR-27b抑制物和0.8 μg GHET1-mut报告载体。48 h后1 200 r/min离心5 min收集细胞，采用荧光素酶检测试剂盒检测各组海肾和萤火虫的荧光值。以萤火虫的荧光值为参照，比较各组相对荧光素酶活性。

1.10   统计学方法

采用SPSS27.0与GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，每种试验独立重复3次。计数资料结果用例（%）表示，以卡方检验进行统计比较。计量资料结果采用（x±s）表示，癌与癌旁组织中GHET1与miR-27b的表达比较采用配对t检验，其他两组之间的统计比较采用独立样本t检验。三组或三组以上之间的统计比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。采用Spearman相关系数检验评估GHET1与miR-27b表达之间的相关性。采用Kaplan-Meier曲线评估GHET1表达与胆囊癌患者预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   GHET1与miR-27b在胆囊癌中的表达及其相关性

实时荧光定量PCR结果显示，癌组织与癌旁组织中GHET1的相对表达水平分别为0.66±0.19和0.40±0.17，癌组织中GHET1表达较癌旁组织高（P<0.001），见图 1A。癌组织与癌旁组织中miR-27b的相对表达水平分别为0.023±0.006和0.045±0.013，癌组织中miR-27b表达较癌旁组织低（P<0.001），见图 1B。GHET1与miR-27b表达呈负相关，相关系数为-0.59（P<0.001），见图 1C。

图  1  GHET1与miR-27b在胆囊癌中的表达(A, B)及其相关性(C)

Figure  1  Expression of GHET1 and miR-27b in gallbladder cancer(A, B) and their correlation(C)

***: P<0.001, compared with paracancerous tissues.

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2.2   GHET1表达与胆囊癌患者临床病理特征以及预后的关系

以癌组织中GHET1表达的中位数值（0.64）为临界点，将胆囊癌患者分为GHET1低表达组（n=25）与GHET1高表达组（n=25）。卡方检验结果显示，GHET1表达与淋巴结转移和TNM分期相关（P<0.05），但与年龄、性别、肿瘤大小、病理类型以及组织学等级不相关（P>0.05），见表 1。与低GHET1表达胆囊癌患者比较，高GHET1表达胆囊癌患者两年总体生存率较差（P<0.001），见图 2。

表  1  GHET1表达与胆囊癌患者临床病理特征的关系

Table  1  Relationship between GHET1 expression and clinicopathological characteristics of GBC patients

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图  2  Kaplan-Meier曲线分析GHET1表达与胆囊癌患者预后的关系

Figure  2  Kaplan-Meier curve analysis of relationship between GHET1 expression and prognosis of GBC patients

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2.3   细胞转染效率检测

实时荧光定量PCR结果显示，与对照组比较，GHET1干扰组与GHET1+miR-27b干扰组中GHET1表达下降（P=0.012、0.015），表明si-GHET1载体对GHET1表达具有良好的抑制效果。与对照组比较，miR-27b干扰组与GHET1+miR-27b干扰组中miR-27b表达下降（P=0.007、<0.001），表明miR-27b抑制物对miR-27b表达具有良好的抑制效果，见图 3。

图  3  各组细胞转染效率检测

Figure  3  Transfection efficiency of cells in each group

*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001, compared with the control group.

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2.4   抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞增殖的影响

结果显示，与对照组比较，GHET1干扰组12、24以及48 h细胞OD值下降（P=0.034、0.018、0.012），miR-27b干扰组12、24以及48 h细胞OD值升高（P=0.029、0.011、0.025）。与GHET1干扰组比较，GHET1+miR-27b干扰组12、24以及48 h细胞OD值升高（P=0.042、0.015、0.037），见图 4。该结果表明，抑制GHET1降低SGC-996细胞增殖，而抑制miR-27b促进SGC-996细胞增殖，并且抑制miR-27b可以逆转抑制GHET1对SGC-996细胞增殖的影响。

图  4  抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞增殖的影响

Figure  4  Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on proliferation of SGC-996 cells

*: P<0.05, compared with the control group at the same time point; #: P<0.05, compared with the GHET1 interference group at the same time point.

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2.5   抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，与对照组比较，GHET1干扰组中细胞凋亡率升高（P=0.019），miR-27b干扰组中细胞凋亡率降低（P=0.046）。与GHET1干扰组比较，GHET1+miR-27b干扰组中细胞凋亡率降低（P=0.015），见图 5。该结果表明，抑制GHET1增加SGC-996细胞凋亡，而抑制miR-27b降低SGC-996细胞凋亡，并且抑制miR-27b可以逆转抑制GHET1对SGC-996细胞凋亡的影响。

图  5  抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞凋亡的影响

Figure  5  Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on apoptosis of SGC-996 cells

*: P<0.05, compared with the control group; #: P<0.05, compared with the GHET1 interference group. Blue boxes represented the apoptotic cells.

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2.6   抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞转移的影响

Transwell试验结果显示，与对照组比较，GHET1干扰组中细胞转移数量降低（P=0.033），miR-27b干扰组中细胞转移数量升高（P=0.027）。与GHET1干扰组比较，GHET1+miR-27b干扰组中细胞转移数量升高（P=0.031），见图 6。该结果表明，抑制GHET1降低SGC-996细胞转移，而抑制miR-27b促进SGC-996细胞转移，并且抑制miR-27b可以逆转抑制GHET1对SGC-996细胞转移的影响。

图  6  抑制GHET1和miR-27b对SGC-996细胞转移的影响(×400)

Figure  6  Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on metastasis of SGC-996 cells (×400)

*: P<0.05, compared with the control group; #: P<0.05, compared with the GHET1 interference group.

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2.7   GHET1对miR-27b的调控作用

生物信息学分析结果显示，GHET1中“ACUGUGA”序列与miR-27b中“UGACACU”序列完全互补配对；荧光素酶报告基因试验结果显示，与对照组比较，miR-27b干扰组中GHET1-wt报告载体的相对荧光素酶活性增加（P<0.001），GHET1-mut报告载体的相对荧光素酶活性无明显改变（P>0.05）；实时荧光定量PCR结果显示，对照组和GHET1干扰组中miR-27b的相对表达水平分别为1.0±0.08和2.53±0.29，差异有统计学意义（P<0.001），见图 7。该结果表明，GHET1可以海绵吸附miR-27b并抑制其表达。

图  7  GHET1对miR-27b的调控作用

Figure  7  Regulation of GHET1 on miR-27b

***: P<0.001, compared with the control group.

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3   讨论

近年来，靶向表观遗传因子是治疗疾病的一种新思路，尤其在恶性肿瘤中具有较大潜力。越来越多的证据显示，lncRNAs作为一类表观遗传因子在胆囊癌中异常表达并影响肿瘤进展，了解其作用机制将为该病的治疗提供新的分子靶点^[6-7]。例如，Zhang等^[8]报道H19在胆囊癌中表达上调，过表达H19可促进胆囊癌细胞增殖和转移。Lu等^[9]发现小核宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1, SNHG1）在胆囊癌中呈现高表达，抑制SNHG1可降低胆囊癌细胞增殖和转移。Gao等^[10]通过一系列细胞实验证实沉默叉头框蛋白D2相邻相反链RNA 1（FOXD2 adjacent opposite strand RNA 1, FOXD2-AS1）可以使胆囊癌进展受到一定的抑制。此外，TTN反义RNA1（TTN antisense RNA 1, TTN-AS1）被报道在胆囊癌进展过程中发挥促癌因子作用^[11]。GHET1定位于人染色体7q36.1位置，长度为1 903 nt。作为胃癌中研究最多的lncRNA之一，GHET1与细胞增殖、细胞周期、转移以及多重耐药密切相关^[12-13]。本研究发现，GHET1促进胆囊癌细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡，有助于进一步完善GHET1在肿瘤中的功能注释。

本研究首先分析GHET1在50例胆囊癌样本中的表达，发现癌组织中该基因的表达高于癌旁组织，与其他肿瘤样本中的表达基本一致^[4]。随后通过分析GHET1表达与胆囊癌患者预后的关系，发现高GHET1表达预示不良预后，提示GHET1可能用于监测胆囊癌预后，但仍需要大样本、多中心试验验证。此外，还发现GHET1表达与TNM分期和淋巴结转移相关。该结果与已发表的Meta分析结果相符^[14]。

GHET1相较其他的lncRNA表现出高稳定性和特异性，在肿瘤治疗方面显示出较大的潜力。通过MTT法、流式细胞术以及Transwell试验，本研究发现抑制GHET1可降低SGC-996细胞增殖和转移，并增加细胞凋亡。该结果与Liu等^[15]和Han等^[16]结果一致，初步揭示GHET1在胆囊癌进展中发挥促癌因子作用。后续研究将在其他的胆囊癌细胞株如GBC-SD和NOZ中验证该结果。

作为一种研究较多的miRNA，miR-27b在多种肿瘤中参与调控细胞生物学行为。例如，Bao等^[17]报道miR-27b通过激活Hippo信号通路抑制胃癌细胞转移和上皮-间充质转化。Li等^[18]发现miR-27b靶向Engrailed同源盒蛋白2（engrailed homeobox 2, EN2）抑制膀胱癌细胞增殖和侵袭。Miao等^[19]发现miR-27b通过调控Yes相关蛋白1（Yes1 associated transcriptional regulator, YAP1）抑制胶质瘤细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡。本研究发现miR-27b在胆囊癌组织的表达低于癌旁组织，与其他肿瘤中报道的结果一致^[5]。随后一系列体外细胞实验结果证实，抑制miR-27b促进SGC-996细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡。由此初步表明，miR-27b在胆囊癌进展中发挥抑癌因子作用。需要注意的是，该结果需在GBC-SD和NOZ细胞株中进一步验证。

研究表明，lncRNAs主要通过海绵吸附下游miRNAs而发挥转录调节作用^[20]。鉴于GHET1与miR-27b在胆囊癌进展中的作用截然相反，且胆囊癌中GHET1与miR-27b表达呈负相关。另外，生物信息学预测显示，GHET1中“ACUGUGA“序列可以与miR-27b中“UGACACU”序列特异性结合。基于以上证据，我们推测miR-27b可能受到GHET1直接调控。随后经荧光素酶报告基因试验证实，GHET1可以通过海绵吸附方式下调miR-27b表达。为了明确GHET1是否通过靶向miR-27b影响胆囊癌进展，我们在SGC-996细胞中同时抑制GHET1和miR-27b。结果发现，细胞增殖和转移较单独抑制GHET1增加，而细胞凋亡较单独抑制GHET1降低，表明抑制miR-27b可以逆转抑制GHET1对SGC-996细胞增殖、转移以及凋亡的影响。后续将通过实验在胆囊癌细胞中上调GHET1的同时上调miR-27b，观察细胞增殖、转移以及凋亡的改变。同时在动物模型中验证GHET1/miR-27b轴对体内胆囊癌生长与转移的影响。如果体内与体外功能一致，将来研发靶向GHET1的小分子药物或许可以起到有效的抗癌作用。

综上所述，GHET1在胆囊癌中表达上调，GHET1表达与TNM分期和淋巴结转移相关，高GHET1表达预示不良预后。GHET1靶向miR-27b促进胆囊癌细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡，表明GHET1/miR-27b轴在胆囊癌进展中具有一定的作用。