0   引言

食管癌是我国最常见的恶性消化道肿瘤之一，居恶性肿瘤发病率第六位，死亡率第四位，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）约占所有食管癌的90%^[1-2]。由于食管癌早期临床症状隐匿，且患者缺乏肿瘤预防、筛查理念，导致大部分患者在确诊时已是中晚期。食管癌的5年生存率约为15%~25%，肿瘤局部复发和远处转移是导致治疗失败的主要原因^[3]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤发生迁移和侵袭的关键过程。转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路对肿瘤的生长转移起到促进作用，是启动EMT的重要通路之一^[4-6]。长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是指超过200个核苷酸的非编码RNA，研究表明许多lncRNA参与调控恶性肿瘤的发生发展。值得注意的是，一些lncRNA已被证实参与TGF-β诱导的EMT^[7-9]。TGF-β通过SMAD2/3上调lnc-UTGF表达，反过来lnc-UTGF可进一步激活TGF-β/SMAD通路，形成TGF-β/SMAD/lnc-UTGF正反馈环路，从而促进肝癌的侵袭和转移^[10]。哺乳动物中存在三种TGF-β亚型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1是恶性肿瘤中表达最多的亚型，与TGF-β信号激活最密切相关。Liu等发现TGF-β1通过上调lncRNA MALAT1表达进而诱导ESCC细胞的EMT、转移和侵袭^[11]。

PTEN假基因lncRNA PTENP1位于人染色体9p13.3，为高度保守的非编码序列，与PTEN高度同源，是一种在恶性肿瘤中缺失或高度甲基化的抑癌基因^[12]。前期研究发现PTENP1在ESCC组织中相对低表达，并与ESCC患者预后不良相关^[13]。同时，有报道表明PTENP1可通过竞争性结合miR-160b使PTEN表达上调，从而抑制宫颈癌细胞增殖和EMT^[14]。但是，PTENP1是否参与TGF-β诱导的食管鳞癌EMT过程尚未见研究报道。本研究旨在探讨PTENP1在TGF-β1介导EMT过程中的作用，明确PTENP1调控ESCC转移的机制。

1   材料与方法

1.1   材料

人ESCC细胞株Eca109和TE-1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM高糖培养基和RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；Transwell小室购自美国Corning公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH抗体均购自美国CST公司。TGF-β1细胞因子购自美国Peprotech公司，另TGF-β1处理组经人重组TGF-β1（10 ng/ml）细胞因子处理48 h。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

Eca109细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，TE-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，置于5%CO₂、37℃培养箱内，待细胞生长至80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.2   PTENP1

3'UTR过表达稳转细胞株的构建取对数生长期的Eca109和TE-1细胞，接种于培养皿中，5%CO₂、37℃条件下培养24 h，待细胞覆盖率为70%左右时，进行转染。用含8 μg/ml Polybrene的新鲜培养基按适合的MOI值稀释病毒液，弃掉培养皿中原有的培养基，分为对照组和处理组，将慢病毒对照稀释液加至对照组中，将PTENP1 3'UTR过表达慢病毒稀释液加至处理组中。48 h后更换成普通培养液，并添加嘌呤霉素筛选，存活的细胞即为表达PTENP1 3'UTR或阴性对照的细胞。为获得稳定转染的单克隆细胞株，将100个用嘌呤霉素筛选培养的细胞接种于培养皿中，3周后分别挑选各个抗嘌呤霉素克隆接种于96孔板中，继续用嘌呤霉素培养，5周后可获得稳定转染的细胞株。

1.2.3   CCK-8实验

取对数生长期的细胞，胰酶消化离心制备细胞悬液，按每孔3 000个细胞种植于96孔板，每组设置3个复孔。分别培养24、48、72、96 h后，取出培养板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育3 h，用酶标仪测定每孔在450 nm处的吸光度值。

1.2.4   Transwell迁移实验

取对数生长期的细胞，用胰酶消化离心后，用无血清培养基重悬成单细胞悬液。将600 μl含有20%血清的培养基加至24孔板，将150 μl含有2×10⁵个细胞悬液加至上室，放至培养箱中继续培养24 h。取出小室，弃掉上室液体，每孔加入600 μl甲醇固定20~30 min，1%结晶紫染色30 min，PBS充分清洗干净，室温晾干小室，显微镜下拍摄照片，随机取5个视野计数，统计结果。

1.2.5   qRT-PCR实验

TRIzol法提取细胞中的总RNA，反转录PCR获得cDNA，GAPDH作为定量的内参对照，扩增条件为：95℃预变性30 s。95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。采用Bio-Rad CFX Manager软件采集数据，并用ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。每个样本独立重复实验3次。引物序列如下：GAPDH-F: 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’, GAPDH-R: 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；PTENP1-F: 5’-TCAGAACATGGCATACACCAA-3’, PTENP1-R: 5’-TGATGACGTCCGATTTTTCA-3’。

1.2.6   Western blot实验

取对数生长期的细胞，加入150 μl裂解混合液，冰上裂解20 min后收集细胞裂解物，4℃ 12 000 r/min离心20 min，吸取上清液，BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5 h。均匀滴加适量ECL化学发光液至PVDF膜上，然后将膜置于Bio-Rad显像仪中，采用Image J软件进行图像采集。

1.3   统计学方法

采用GraphPad软件进行统计学分析，所有定量结果表示为至少3次独立实验的平均值±标准偏差（x±s）。使用Student t检验、ANOVA单因素方差分析组间差异，P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   TGF-β抑制ESCC细胞PTENP1的表达

采用qRT-PCR检测TGF-β1处理前后ESCC细胞PTENP1的表达水平。结果显示，与对照组相比，Eca109和TE-1细胞经TGF-β1处理48 h后，PTENP1的表达水平显著降低（P < 0.05），见图 1，表明TGF-β抑制PTENP1的表达。

图  1  qRT-PCR检测TGF-β1诱导48 h后ESCC细胞PTENP1的表达

Figure  1  PTENP1 expression in ESCC cells treated with TGF-β1 for 48 h detected by qRT-PCR

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2.2   过表达PTENP1 3’UTR慢病毒载体转染验证

为进一步证实PTENP1对ESCC细胞生物学行为的影响及PTENP1是否参与TGF-β诱导的EMT过程，我们构建了PTENP1 3’UTR过表达慢病毒载体，转染Eca109、TE-1细胞，经嘌呤霉素筛选后通过qRT-PCR检测，结果显示，与对照组相比，转染PTENP1 3’UTR后PTENP1的表达显著增加（P < 0.05），见图 2，表明PTENP1过表达稳转细胞株构建成功。

图  2  qRT-PCR检测转染PTENP1 3’UTR后ESCC细胞PTENP1的表达

Figure  2  PTENP1 expression in ESCC cells transfected with PTENP1 3ʹUTR detected by qRT-PCR

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2.3   过表达PTENP1抑制ESCC细胞的EMT

Western blot检测过表达PTENP1 3’UTR后Eca109和TE-1细胞中EMT标志物蛋白表达的水平。结果显示（P < 0.05），过表达PTENP1 3’UTR Eca109、TE-1细胞的E-cadherin表达水平明显高于对照组，而N-cadherin和Vimentin的表达水平显著下降，见图 3。表明过表达PTENP1可以抑制食管鳞癌细胞的EMT。

图  3  Western blot检测过表达PTENP1 3’UTR后Eca109(A)和TE-1细胞(B)EMT相关蛋白的表达

Figure  3  EMT makers expression in Eca109(A) and TE-1 (B) cells transfected with PTENP1 3'UTR detected by Western blot analysis

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2.4   过表达PTENP1抑制ESCC细胞增殖和迁移

Transwell实验检测过表达PTENP1 3’UTR对Eca109和TE-1细胞迁移能力的影响。分别将相同数量过表达PTENP1 3’UTR和对照组细胞接种至Transwell小室中，观察24 h后穿过小室的细胞数，结果显示，PTENP1过表达后，Eca109和TE-1细胞的迁移能力显著下降（P < 0.05），见图 4。

图  4  Transwell检测过表达PTENP1 3’UTR对Eca109(A)和TE-1细胞(B)迁移能力的影响

Figure  4  Migration of Eca109(A) and TE-1(B) cells transfected with PTENP1 3ʹUTR detected by Transwell assay

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通过CCK-8实验分析过表达PTENP1对ESCC细胞增殖的影响，结果发现，与对照组相比，过表达PTENP1显著抑制了Eca109和TE-1细胞的增殖能力（P < 0.05），见图 5。

图  5  CCK-8检测过表达PTENP1 3’UTR对Eca109和TE-1细胞增殖能力的影响

Figure  5  Proliferation of Eca109 and TE-1 cells transfected with PTENP1 3ʹUTR detected by CCK-8 assay

^*: P < 0.05, compared with control group.

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2.5   过表达PTENP1部分逆转TGF-β诱导的EMT过程

Western blot检测发现，Eca109和TE-1细胞经TGF-β1诱导后，E-cadherin的表达水平降低，同时N-cadherin和Vimentin表达上调，证实了TGF-β可促进ESCC细胞发生EMT。而过表达PTENP1抑制了TGF-β1诱导的E-cadherin表达减少和N-cadherin、Vimentin表达升高（均P < 0.05），见图 6。Transwell迁移实验结果显示，Eca109和TE-1细胞经TGF-β1诱导48 h后，迁移能力明显增强；而过表达PTENP1可削弱TGF-β1对Eca109细胞迁移能力的促进作用（均P < 0.05），见图 7。这些结果说明，PTENP1过表达可部分逆转TGF-β1诱导的EMT过程。

图  6  Western blot检测过表达PTENP1 3’UTR对TGF-β1诱导Eca109(A)和TE-1细胞(B)EMT相关蛋白的影响

Figure  6  EMT markers expression in Eca109(A) and TE-1 (B) cells cultured with TGF-β1 after transfection with PTENP1 3ʹUTR detected by Western blot analysis

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图  7  Transwell检测过表达PTENP1 3’UTR对TGF-β1诱导Eca109(A)和TE-1细胞(B)迁移能力的影响

Figure  7  Migration of Eca109-PTENP1 3ʹUTR(A) and TE-1-PTENP1 3ʹUTR cells(B) after treatment with TGF-β1 detected by Transwell assay

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3   讨论

食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，局部复发和转移是导致食管癌患者预后差的主要原因。因此，探索食管癌转移的分子机制，具有重要的临床意义。食管癌的转移是多分子参与、相互调控的复杂生物学过程，多种基因和信号通路参与其中。TGF-β在细胞生长、分化、凋亡、侵袭等过程中发挥重要作用，TGF-β通路介导的EMT是肿瘤发生侵袭、迁移的重要机制之一。前期研究发现PTENP1在ESCC组织中低表达，与患者TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移及预后不良相关^[13]。而PTENP1是否与ESCC的侵袭、迁移能力有关，其是否参与调控TGF-β介导的EMT尚未见研究报道。本研究结果发现，TGF-β可抑制食管鳞癌细胞PTENP1的表达，过表达PTENP1可抑制食管鳞癌细胞增殖和迁移，并部分逆转TGF-β诱导的EMT过程。

TGF-β信号通路通过调节多种mRNA及其编码蛋白，影响肿瘤EMT、浸润转移、免疫微环境、治疗抵抗等生物学过程。但是TGF-β信号通路在肿瘤发生发展中的作用具有双重性，在肿瘤发生发展的早期，TGF-β可以抑制肿瘤生长，阻止肿瘤的发展。而在肿瘤进展期，随着肿瘤表观遗传改变，TGF-β则对肿瘤的生长和转移起到促进作用^[15-17]。因此阐明TGF-β调控肿瘤进展的分子机制，对开发潜在的肿瘤治疗靶点具有重要意义。近年来随着对非编码RNA与肿瘤发生发展关系的研究深入，学者发现lncRNA可作为TGF-β信号转导的效应因子影响肿瘤的EMT和侵袭转移^[7]。TGF-β可上调lncRNA-ATB表达促进肝癌细胞EMT过程，其下游机制为lncRNA-ATB可通过竞争性结合miR-200，从而使miR-200靶基因ZEB1/2表达升高^[18]。在肺癌细胞中，TGF-β/SMAD3通路可抑制LINC01186的表达，从而促进肿瘤的侵袭、迁移和EMT过程^[19]。PTENP1作为内源性RNA，其转录本主要通过竞争性结合相关miRNA，在转录后水平调节PTEN的表达，从而影响肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移。Qian等发现过表达PTENP1通过吸附miR-193a-3p调控PTEN/Akt信号通路，从而抑制肝癌细胞的侵袭和转移^[20]。Fan等发现PTENP1通过竞争性结合miR-106b调控PTEN表达，抑制宫颈癌细胞增殖和EMT^[14]。然而，PTENP1是否参与TGF-β介导的食管鳞癌细胞EMT和侵袭转移尚未可知。本研究通过qRT-PCR比较TGF-β1处理前后食管鳞癌Eca109细胞中PTENP1表达的变化，发现经TGF-β1处理后，lncRNA PTENP1的表达明显下降。进一步构建了PTENP1 3’UTR过表达慢病毒载体，体外功能实验结果发现，过表达PTENP1可抑制食管鳞癌细胞的迁移和增殖能力。表明PTENP1在ESCC的肿瘤侵袭转移中发挥潜在作用。过表达PTENP1 3’UTR后，Eca109和TE-1细胞中EMT标志物E-cadherin表达增加，而N-cadherin和Vimentin表达下降，提示PTENP1可通过调控EMT过程抑制食管癌迁移能力。进一步的挽救实验表明，过表达PTENP1可以部分削弱TGF-β1对Eca109和TE-1细胞迁移能力的影响。同时，过表达PTENP1 3’UTR抑制了TGF-β1诱导的E-cadherin降低及N-cadherin和Vimentin升高，证实PTENP1参与调控TGF-β1诱导的食管鳞癌EMT过程。

但是TGF-β抑制PTENP1表达的具体机制，以及PTENP1如何调控EMT相关标志物表达的分子机制尚未完全清楚。Smad通路是TGF-β信号下游最经典和直接的通路，研究发现，在TGF-β刺激下，Smad2/3通过结合至lncRNA SMASR启动子区，抑制SMASR转录和表达，从而促进肺癌的EMT和迁移侵袭^[21]。此外，Li等研究表明，TGF-β1通过将HDAC3富集于lncRNA ANCR启动子区，降低ANCR启动子的乙酰化水平，使其表达下调，从而促进乳腺癌的侵袭和转移^[22]。回顾文献发现，在多种肿瘤中，PTENP1的基因启动子区域存在甲基化位点，并且PTENP1甲基化水平与自身表达水平呈负相关。Cao等发现，miR-21通过作用下游靶蛋白TETs，提高PTENP1启动子甲基化水平，从而影响PTENP1的表达，促进肝癌发生发展^[23]。PTENP1在肾癌细胞系和组织中表达较低，且其启动子区高度甲基化^[24]。基于这些事实，推测ESCC中PTENP1的表达水平受其基因启动子区甲基化位点调控，而TGF-β/Smad通路是否可能通过与PTENP1启动子结合来调控其表达，需要后续进一步研究证实。此外，研究发现，lncRNA主要通过竞争性结合相关miRNA如miR-200家族，在转录后水平调节EMT相关转录因子的表达^[18-25]。PTENP1作为竞争性内源RNA，主要通过竞争性结合相关miRNA，包括miR-20a、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-17和miR-214等在转录后水平调节PTEN或其他基因如SOCS6的表达，从而影响肿瘤的发生、发展、浸润和转移^[12]。那么，PTENP1是否通过调控某些miRNA影响ESCC的EMT过程？我们后续会开展进一步的研究，阐明TGF-β信号通路调控PTENP1的具体分子机制以及PTENP1调控EMT的下游分子机制。

综上，PTENP1在TGF-β诱导的食管鳞癌EMT过程发挥重要作用，这一发现将为食管癌的诊疗提供新策略和新靶点。