0   引言

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球危害人类健康常见的恶性肿瘤之一。由于肿瘤复杂的发病机制和异质性，就诊时多数已发生肝内外转移，预后较差。阿克替苷（acteoside, ACT），是一种水溶性的苯丙素苷类化合物，具有抗氧化^[1]、抗炎^[2]、抗菌^[3]、抗动脉粥样硬化^[4]、抗肿瘤^[5]等多种药理活性。ACT在肝癌细胞中的具体作用和机制尚无更深入的研究。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions, EMT）作为恶性肿瘤侵袭和转移的第一步，是一个动态、可逆的过程，而抑制EMT发生可作为抑制肿瘤侵袭及转移的一种重要手段。恶性肿瘤的发生和发展与细胞信号转导通路的异常调控有关^[6]。细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2）作为MAPK信号通路的亚通路在肝癌细胞的EMT、侵袭及迁移过程中发挥重要作用^[7]。目前尚未见有关ACT通过ERK1/2信号通路影响肝癌细胞EMT的具体作用和机制的研究报道。因此，本实验拟初步探讨ERK1/2信号通路在肝癌细胞中的表达，并通过细胞学实验探讨中草药化合物ACT与肝癌生物学机制的相关性，为ACT治疗肝癌提供实验依据和理论基础。

1   材料与方法

1.1   细胞株和试剂

人肝癌HCCLM3细胞（中国上海科学院上海细胞库）；ACT（南京景竹生物科技有限公司）；高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白、CCK-8试剂（均购自美国Gibco公司）；胎牛血清（美国沃卡威生物技术有限公司）；PBS（美国Labconco公司）；无血清冻存液（英国Whatman公司）；0.1%结晶紫（北京索莱宝生物科技有限公司）；ERK1/2抑制剂PD98059、SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂预混液、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（均购自美国MedChemExpress公司）；5×蛋白上样缓冲液、RIPA强裂解液、PMSF裂解液、10% SDS、Tris-HCL缓冲液、PAGE胶凝固剂、促凝剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL Plus化学发光显色液（均购自北京Solarbio科技有限公司）；E-cadherin抗体（ab231303）、N-cadherin抗体（ab76011）（均购自英国Abcam公司）；ERK1/2抗体（AF0155）、p-ERK1/2抗体（AF1015）、Beta actin抗体（AF7018）、辣根酶标记酶山羊抗兔IgG（S0001）（均购自美国Affinity公司）。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

肝癌HCCLM3细胞用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素双抗（1×10⁵u/L）的高糖DMEM培养液，常规复苏细胞后，置于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行细胞换液、传代、冻存或用于后续实验。

1.2.2   CCK-8法检测细胞的增殖

按药物浓度设置5组（0、40、80、120、160 µmol/L），取对数生长期的肝癌HCCLM3细胞，各组按5×10³个细胞/孔接种于3个96孔板，每组设置5个复孔，细胞培养板置于培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，加入上述不同浓度的ACT药物，分别继续培养24、48、72 h后，每孔加入10 µl CCK-8溶液培养30 min，酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度（OD）值，分析细胞的增殖能力，根据OD值计算细胞抑制率，并筛选出最佳抑制浓度和时间。

细胞抑制率=（对照组OD值－实验组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%。

1.2.3   划痕实验检测细胞的运动能力

在铺板前用Marker笔在6孔板背面均匀划横线，每孔3~5条。将肝癌HCCLM3细胞按5×10⁵个/孔接种于培养板中，每组设置3个复孔，置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中，待75%~85%细胞贴壁后用10 µl枪头垂直划痕。磷酸盐缓冲溶液PBS洗细胞3次，加入不同浓度ACT。分别在0、12、24 h后每孔选取5个视野在显微镜下拍照记录。

1.2.4   Transwell实验检测肝癌细胞侵袭及迁移实验

在4℃条件下将基质胶按1:8稀释，吸取60 µl包被Transwell小室上室面，置于培养箱使基质胶聚合成凝胶。取对数生长期的细胞，细胞贴壁后加入不同浓度的ACT处理24 h。制备细胞悬液，用无血清培养基重悬细胞。计数并调整细胞密度为（1×10⁴~1×10⁵）个/毫升。吸取200 µl细胞悬液加入小室。24孔板下室加入600 µl含20%血清的培养基，培养24 h。取出小室，放入烧杯中PBS洗2遍，95%乙醇固定30 min。用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍。放置在显微镜下观察，分别选取五个视野，用Image J软件计数穿过小室的肝癌细胞数。迁移实验在小室底部膜的上室不铺胶，其余步骤同侵袭实验。实验重复3次。

1.2.5   实时定量PCR检测ACT对ERK1/2信号通路和EMT相关基因mRNA的表达

不同浓度的ACT处理细胞24 h，按照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒说明书进行操作，分别提取细胞的总RNA，荧光定量PCR仪检测ERK1/2信号通路和EMT相关基因在mRNA水平的表达量。ERK1基因上游引物序列为5'-TCAACACCACCTGCGACCT-3'，下游为5'-CGTAGCCACCTGCGACCT-3'；ERK2基因上游引物为5'-TGGAGCAGTATTACGACCCG-3'，下游为5'-TTGAGCTTTTCCTTAGGCAAGT-3'；E-cadherin基因上游引物为5'-GCCCCGCCTTATGATTCTC-3'；下游为5'-GCCCCATTCGTTCAAGTAGTC-3'；N-cadherin上游基因引物为5'-ACCAGGTTTGGAATGGGACA-3'，下游为5'-TTGGGTGAAGGGGTGCTTG-3'；GAPDH基因上游引物为5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游为5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGAG-3'。反转录条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。PCR扩增反应采用Real-time PCR试剂盒SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit进行，反应条件为95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s进行40个循坏，所有信息由荧光定量PCR仪收集。2^-ΔΔct法分析实验数据。

1.2.6   蛋白质印迹实验检测ACT对ERK1/2信号通路和EMT相关蛋白的表达

取对数生长期的肝癌细胞，加入无血清培养基饥饿细胞24 h，加入不同浓度ACT处理24 h，按细胞裂解液说明书提取细胞蛋白。按照BCA试剂盒说明书，检测各组蛋白浓度。蛋白上样每孔取20 µg蛋白。蛋白电泳条件是上胶80 V，30 min，分离胶120 V，1.5 h，电泳后用1×TBST清洗3次、每次8 min后进行转膜，转膜条件是2300 MA、转膜2 h。转膜后用含5%脱脂奶粉封闭2 h，封闭完成后分别添加一抗anti-ERK1/2（1:1 000）、anti-p-ERK1/2（1:2 000）、anti-E-cadherin（1:1 000）、anti-N-cadherin（1:10 000）、anti-Beta actin（1:1 0000），4℃孵育过夜，1×TBST缓冲液洗膜3次，添加二抗IgG（1:5 000）室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光液曝光，拍照记录，使用Image J软件计算条带灰度值，并分析结果。

1.3   统计学方法

采用SPSS25.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示；多组之间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验分析；P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   ACT对肝癌细胞增殖的影响

随着ACT药物浓度和作用时间的增加，可明显抑制肝癌HCCLM3细胞的增殖。当ACT浓度在160 µmol/L且作用时间为24 h时，其对人肝癌HCCLM3细胞的抑制作用最明显，并计算IC₅₀约为102 µmol/L，见表 1。因此，依据上述实验结果，我们拟选择ACT低浓度80 µmol/L和高浓度120 µmol/L、且作用时间为24 h进行后续实验。

表  1  ACT对HCCLM3肝癌细胞增殖抑制率的影响(%)

Table  1  Effect of ACT on proliferation inhibition rate of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells (%)

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2.2   ACT对肝癌细胞迁移能力的影响

将实验分为4组，即对照组（0 µmol/L）、ACT浓度80 µmol/L组、ACT浓度120 µmol/L组、阳性对照组（PD98059抑制剂组）。划痕实验结果显示，四组肝癌HCCLM3细胞作用0、12、24 h后，与对照组相比，随着ACT药物浓度增加细胞迁移能力明显降低；与PD98059抑制剂组相比，ACT浓度80 µmol/L和120 µmol/L组细胞迁移能力差异无统计学意义（P > 0.05），见图 1、表 2。Transwell迁移实验表明，4组肝癌细胞作用24 h后，80 µmol/L和120 µmol/L ACT组细胞的迁移数与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.001），PD98059抑制剂组与120 µmol/L组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2、表 2。

图  1  划痕实验检测ACT对肝癌HCCLM3细胞迁移能力的影响(×10)

Figure  1  Effect of ACT on migration ability of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells by scratch test (×10)

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表  2  各组肝癌HCCLM3细胞迁移和侵袭数目比较(n=6, x±s)

Table  2  Comparison of migration and invasion number of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells among the groups (n=6, x±s)

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图  2  Transwell实验检测ACT对肝癌HCCLM3细胞迁移能力的影响(×20)

Figure  2  Effect of ACT on migration ability of hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells by Transwell test (×20)

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2.3   ACT对肝癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验表明，作用24 h后，与对照组相比，ACT 80 µmol/L组侵袭细胞数差异有统计学意义（P < 0.05）；PD98059抑制剂组与120 µmol/L组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 3和表 2。这表明ACT能抑制肝癌HCCLM3细胞的侵袭能力，并随药物浓度增加其能力越弱。

图  3  Transwell侵袭实验检测ACT对肝癌HCCLM3细胞侵袭能力的影响(×20)

Figure  3  Effect of ACT on invasion ability of hepatoma HCCLM3 cells by Transwell test (×20)

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2.4   ACT通过ERK1/2信号通路对肝癌细胞EMT相关基因mRNA的影响

2.4.1   ACT对ERK1/2信号通路基因mRNA的影响

对照组ERK1 mRNA的表达与ACT 120 µmol/L组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），见图 4A；ACT 120 µmol/L组和PD98059抑制剂组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。ACT 120 µmol/L组ERK2 mRNA的表达与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）；而其余各组差异均无统计学意义，见图 4B。这表明ACT对肝癌细胞的作用与ERK1/2信号通路相关。

图  4  ACT对肝癌细胞ERK1(A)、ERK2(B)、E-cadherin(C)、N-cadherin(D) mRNA的表达

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, ns: no statistical difference.

Figure  4  Effect of ACT on mRNA expression of ERK1(A), ERK2(B), E-cadherin(C), and N-cadherin(D) in hepatocellular carcinoma cells

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2.4.2   ACT对肝癌细胞EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin mRNA的影响

与对照组相比，各实验组E-cadherin mRNA表达上调，见图 4C；而ACT 120 μmol/L组与PD98059抑制剂组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组相比，各实验组N-cadherin mRNA表达明显下调，且随着药物浓度的增高下调更显著；ACT 120 μmol/L组与PD98059抑制剂组相比差异无统计学意义（P > 0.05），见图 4D。

2.5   ACT通过ERK1/2信号通路对肝癌细胞EMT相关蛋白的影响

2.5.1   ACT对ERK1/2信号通路蛋白的影响

Western blot法测定各组细胞中ERK1/2、p-ERK1/2信号通路关键蛋白的表达水平，见图 5。各组ERK1/2蛋白的表达差异无统计学意义（P > 0.05），见图 6A~B。

图  5  肝癌细胞ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

Figure  5  Protein expression of ERK1/2, p-ERK1/2, E-cadherin and N-cadherin in hepatocellular carcinoma cells

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2.5.2   ACT对EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的影响

与对照组相比，各实验组E-cadherin蛋白的表达明显上调，其中，ACT 120 μmol/L组上调更显著（P < 0.0001）；而ACT 120 μmol/L组与PD98059抑制剂组相比差异无统计学意义（P > 0.05），见图 6C。与对照组相比，各实验组间N-cadherin蛋白的表达明显下调，差异有统计学意义；ACT 120 μmol/L组与PD98059抑制剂组相比差异无统计学意义（P > 0.05），见图 6D。

图  6  ACT对肝癌细胞ERK1/2(A)、p-ERK1/2(B)、E-cadherin(C)、N-cadherin(D)蛋白水平的影响

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, ****: P < 0.0001; ns: no statistical difference.

Figure  6  Effect of ACT on protein levels of ERK1/2(A), p-ERK1/2(B), E-cadherin(C) and N-cadherin(D)

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3   讨论

ACT是从多种中草药中提取的一种水溶性化合物，可通过多靶点、多途径抑制恶性肿瘤，如口腔鳞状细胞癌^[8]、结肠癌^[9]和胶质细胞瘤^[10]的发生和发展。本课题组前期研究表明，ACT可通过调控ERK5、p38MAPK、JNK信号通路进而抑制肝癌细胞的生物学变化^{[7, 11-12]}。ERK1/2作为MAPK信号通路的亚通路，其是否也可影响肝癌细胞的EMT尚无报道。为了进一步研究ACT是否通过调控ERK1/2信号通路抑制肝癌HCCLM3细胞的EMT、侵袭和转移，本实验发现，ACT可明显抑制肝癌HCCLM3细胞的增殖、侵袭和迁移。

ERK1/2是MAPK信号通路的亚通路，越来越多的研究表明其在肝细胞癌中异常表达。Zhao等^[13]的研究表明槲皮素作为一种有效的肝脏保护剂，在肝癌晚期可通过MEK1/ERK1/2信号通路进而抑制癌细胞增殖和扩散。赵嘉琪^[14]发现，人参皂苷CK可通过调控ERK1/2通路诱导人肝癌细胞的增殖和线粒体凋亡。李玉龙等^[15]的研究表明，高浓度健脾解毒方能延缓荷瘤鼠恶液质的发生和进展，这提示可能与健脾解毒方上调TCR、ERK1/2及p-ERK1/2有关。吴志贤等^[16]通过构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1，抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长，其机制可能与调控ERK1/2 MAPK信号通路有关。本研究结果显示，ACT作用于肝癌细胞后p-ERK1/2蛋白和mRNA的表达显著降低（P < 0.05），且呈浓度依赖性，而120 µmol ACT与PD98059抑制剂组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。据此，我们推测ACT可通过下调ERK1/2信号通路进而抑制人肝癌HCCLM3细胞的增殖、侵袭及迁移。

EMT的发生是多种蛋白分子、生长因子和转录因子共同作用的结果。肝癌细胞的侵袭迁移与EMT的发生发展密切相关。EMT发生的特点为上皮细胞连接蛋白E-钙黏蛋白基因的表达下调，蛋白质产物N-钙黏蛋白、波形蛋白上调，进而促进间充质黏附。文献^[17]表明，小檗胺可抑制人肝癌SMMC-7721细胞侵袭转移，其机制可能与其调控EMT相关蛋白的表达有关。刘博佳等^[18]实验显示，羽扇豆醇可抑制异种移植HepG2细胞荷瘤小鼠肿瘤的生长，肿瘤组织中E-cadherin蛋白表达增高，N-cadherin蛋白表达降低。本实验前期研究也证实，ACT可抑制肝癌HepG2细胞基质金属蛋白酶的表达，进而抑制肝癌的侵袭及转移^[7]。在前期研究的基础上进一步发现，ACT处理后人肝癌HCCLM3细胞中E-cadherin蛋白和mRNA表达明显增加，而N-cadherin的表达明显下降。进一步证实ACT可抑制肝癌细胞EMT的发生，其可能通过下调ERK1/2信号通路来实现，其具体作用机制与EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达有关。

综上，ACT可通过调控ERK1/2信号通路进而抑制人肝癌HCCLM3细胞上皮间质转化，其具体作用与E-cadherin表达的上调和N-cadherin表达的下调有关。本实验仅是在体外细胞水平研究，仍需行体内实验进一步研究，进而为后续中草药化合物ACT在临床上的进一步开发利用提供理论基础和实验依据。