0   引言

胶质瘤是一种中枢神经系统肿瘤^[1]。世界卫生组织（WHO） 将胶质瘤分为四个等级，其中Ⅳ级胶质瘤恶性程度最高，也称为胶质母细胞瘤（GBM），其两年生存率仅26%，中位生存期仅14.6个月^[2-4]。探索胶质瘤进展的分子机制对于胶质瘤治疗具有重要意义。

各种转录因子可参与调控人类疾病的进展，目前可表达转录因子的基因约占所有致癌基因的20%^[5-8]。E-twenty six（ETS）蛋白是转录因子家族中最大的一个家族之一，在调节多种生物学过程中发挥重要作用^[9]。ETS原癌基因1（ETS proto-oncogene 1, ETS1）是RAS/RAF/ERK通路的下游效应子^[10]。据报道ETS1可参与多种实体瘤的发生发展，如结直肠癌^[11]、宫颈癌^[12]、非小细胞肺癌^[13]。在胶质瘤中，ETS1可通过激活长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）SNHG10转录发挥促癌作用^[14]。然而，ETS1在胶质瘤中的生物学功能和下游调控机制尚未完全阐明。

LncRNA XIST高表达可促进胶质瘤的恶性生物学表型^[15]。本研究中，我们发现ETS1在胶质瘤组织和细胞内高表达，调控肿瘤细胞的增殖和凋亡，且能激活XIST的转录。这些发现揭示了ETS1新的生物学功能，并提示ETS1可能是胶质瘤的治疗靶点。

1   材料与方法

1.1   组织样本收集

收集2019年9月至2022年12月在三峡大学第一临床医学院神经外科收治的58例初诊胶质瘤手术患者的肿瘤组织及其相应的癌旁组织。所有组织样本取出后立即放入液氮中冷冻，随后转移至冰箱中（−80℃）保存。所有患者术前未接受放疗或化疗，患者或家属在组织样本收集前均签署了知情同意书。所有实验方案经本院伦理委员会批准，实验流程严格遵守赫尔辛基宣言。

1.2   细胞培养

胶质瘤细胞系（U251、U87、LN229、LN308）和人星形胶质细胞（NHA）均购自中国典型培养物保藏中心（武汉）。所有细胞系培养于含10%胎牛血清（美国西格玛-奥德里奇公司）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的培养基中，并在5%CO₂、37℃的培养箱中孵育。取对数生长期的细胞用于实验。

1.3   细胞转染

ETS1小干扰RNA（si-ETS1#1和si-ETS1#2），XIST过表达质粒（XIST），ETS1过表达质粒（ETS1）和空白质粒（NC）均购自吉满生物科技有限公司（上海），当细胞融合达60%~80%时，使用Lipofectamine^TM2000（美国英杰公司）将以上siRNA或载体转染U87和LN229细胞系中，转染48 h后，采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染效率，收集细胞用于后续实验。

1.4   免疫组织化学

将石蜡包埋的组织标本切成4 μm厚的切片，二甲苯脱蜡，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，在柠檬酸溶液中煮沸进行抗原修复，然后用3%过氧化氢处理。随后将组织标本与1%FBS孵育，加入抗ETS1抗体（1∶100），4℃下孵育过夜，随后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min后在室温下用DAB孵育5 min进行显色，苏木精对比染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.5   实时定量PCR

TRIzol试剂提取组织和细胞中的RNA，ABI High-Capacity cDNA反转录试剂盒对RNA进行反转录，ABI StepOnePlus实时PCR系统进行实时定量PCR，GAPDH作为内参， 2^-ΔΔCt法计算结果。引物序列：ETS1（正向：5’-GATAGTTGTGATCGCCTCACC-3’； 反向：5’-GTCCTCTGAGTCGAAGCTGTC-3’）；XIST（正向：5’-AGCTCCTCGGACAGCTGTAA-3’； 反向：5’-CTCCAGATAGCTGGCAACC-3’）； GAPDH （正向：5’-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3’，反向：5’-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3’）。

1.6   CCK-8实验

CCK-8试剂盒检测U87细胞系和LN229细胞活性，将细胞以密度为1×10³细胞/孔接种于96孔板上，转染细胞培养24、48和72 h后每孔分别加入10 μl CCK-8试剂，之后在37℃、5%CO₂条件下孵育2 h。使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光度值。

1.7   5-乙炔基-2'-脱氧尿苷实验

EdU试剂盒检测U87和LN229细胞的增殖。取对数生长期细胞，以2×10³个细胞接种于96孔板中，每孔加入200 μl浓度为5 μmol/L EdU溶液，培养2 h，PBS冲洗，随后4%多聚甲醛固定30 min，加入Apollo®荧光染色液，避光孵育30 min，DAPI反应液染色30 min。荧光显微镜下观察细胞，并计算EdU阳性细胞的百分比。

1.8   Western blot实验

RIPA裂解液从细胞中提取蛋白，二喹啉甲酸法（BCA法）定量蛋白。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯薄膜上，之后将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭。然后，将膜与下列一抗于4℃条件下孵育过夜：anti-Bax（1:1000）、anti-Bak（1:1000）、anti-Bcl-2（1:1000）或anti-β-actin （1:1000），随后将膜与二抗（1:2000）于室温孵育2 h后使用ECL化学发光检测试剂盒检测蛋白条带，β-actin为内参。

1.9   双荧光素酶报告基因实验

将ETS1与XIST启动子区域上的结合位点克隆到萤火虫荧光素酶报告载体pGL3中，构建XIST野生型载体（XIST-WT）和XIST突变型载体（XIST-MUT）。随后根据制造商的说明，Lipofectamine^TM 2000将上述载体和ETS1过表达质粒（ETS1）或空白质粒（NC）共转染到U87和LN229细胞中。转染48 h后，使用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性为内参。

1.10   染色质免疫共沉淀-PCR

EZ-ChIP^TM试剂盒进行ChIP实验。将U87和LN229细胞用1%甲醛固定10 min，加入甘氨酸终止固定。刮取细胞并离心以获得细胞沉淀，加入含PMSF的细胞裂解缓冲液悬浮细胞，离心后去掉上清液获得核沉淀物，冰浴超声裂解后，将裂解物分别与一抗 IgG（1∶100）或ETS1一抗在4℃下过夜。随后，蛋白质琼脂糖沉淀DNA-蛋白质复合物，并在4℃下离心5 min。最后，根据EZ-ChIP^TM试剂盒操作说明提取和处理DNA，qRT-PCR检测XIST的DNA水平。

1.11   生物信息学分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析ETS1在胶质瘤组织中的差异表达。UALCAN数据库（ualcan.path.uab.edu/home）分析ETS1在胶质瘤组织以及正常脑组织中的表达。PROMO数据库（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo）预测ETS1与XIST启动子之间的结合位点。cBioPortal数据库（https://www.cbioportal.org/）分析ETS1与XIST在胶质瘤组织中表达的相关性。

1.12   统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有实验进行3次，结果以均数±标准差表示，组间比较使用Student's t test或单因素方差分析，Pearson进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   ETS1在胶质瘤中高表达

首先使用GEPIA数据库分析ETS1在胶质瘤中的差异表达，结果表明ETS1在胶质母细胞瘤（GBM）和低级别胶质瘤（LGG）组织中表达均显著上调，见图1A。另外，UALCAN数据库同样显示ETS1在GBM组织中表达上调，见图1B。IHC染色检测58例胶质瘤组织及其对照正常组织样本中ETS1的表达，结果表明与正常脑组织相比，ETS1在胶质瘤组织中的表达显著上调（χ²=8.838，P=0.003），见图1C。qRT-PCR分析ETS1 mRNA在58例胶质瘤患者肿瘤组织以及正常脑组织中的表达水平，结果显示ETS1 mRNA在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常脑组织见图1D。根据胶质瘤组织中ETS1表达水平的中位数，将58例胶质瘤患者分为高表达组和低表达组，分析ETS1的表达与患者临床病理特征之间的关系，结果显示ETS1高表达与胶质瘤患者TNM分期增加有关，见表1。此外，与人星形胶质细胞（NHA）相比，ETS1 mRNA在4种胶质瘤细胞系（U251、 U87、 LN229、 LN308）中表达水平均显著升高 ，见图1E。

图  1  ETS1在胶质瘤中的表达特征

Figure  1  Expression characteristics of ETS1 in glioma

*: P<0.05, ***: P<0.001; A: the differential expression of ETS1 in glioblastoma and low-grade glioma was analyzed using GEPIA online database; B: the expression of ETS1 in glioma and its adjacent tissues was analyzed using UALCAN database; C: the expression of ETS1 in 58 glioma tissues and adjacent tissues was detected by immunohistochemistry; D-E: the ETS1 mRNA expression levels in 58 glioma tissues and cell lines were detected by qRT-PCR.

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表  1  ETS1在胶质瘤组织中的表达与临床病理资料的关系

Table  1  Relationship between ETS1 expression in glioma tissues and clinicopathological data of patients

Characteristics	ETS1		χ2	P
	High expression (n=29)	Low expression (n=29)
Gender			0.633	0.426
Male	15	18
Female	14	11
Age(years)			1.105	0.293
≥40	13	17
<40	16	12
Diameter of tumors (cm)			0.624	0.430
< 2	12	15
≥2	17	14
No	6	17
WHO staging system			5.695	0.017
3-4	21	12
1-2	8	17

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2.2   敲低ETS1抑制胶质瘤细胞增殖、促进细胞凋亡

为探究ETS1在胶质瘤细胞中的生物学功能，我们将两种ETS1 siRNA（si-ETS1#1、si-ETS1#2）转染入U87和LN229细胞系中，qRT-PCR结果显示转染成功，见图2A。CCK-8实验显示，与si-NC组相比，si-ETS1#1和si-ETS1#2组中胶质瘤细胞的活性显著降低，见图2B。EdU实验同样显示si-ETS1#1和si-ETS1#2组中胶质瘤细胞增殖能力显著低于si-NC组，见图2C。Western blot实验结果显示，与si-NC组相比，si-ETS1#1和si-ETS1#2组细胞中促凋亡蛋白Bax和Bak的表达水平显著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，见图2D。因此，以上结果显示ETS1可促进胶质瘤细胞增殖，并抑制凋亡。

图  2  敲低ETS1抑制胶质瘤细胞增殖、促进细胞凋亡

Figure  2  ETS1 knockdown inhibited glioma cell proliferation and promoted cell apoptosis

*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; A: qRT-PCR was used to detect the expression level of ETS1 mRNA in U87 and LN229 cells after transfection with si-ETS1#1 or si-ETS1#2; B: CCK-8 assay was conducted to detect the activity of U87 and LN229 cells after transfection with si-ETS1#1 or si-ETS1#2; C: EdU assay was used to detect the proliferation of U87 and LN229 cells after transfection with si-ETS1#1 or si-ETS1#2; D: Western blot was adopted to detect the expression levels of apoptosis-related proteins (Bax, Bak, Bcl-2) in U87 and LN229 cells after transfection with si-ETS1#1 or si-ETS1#2.

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2.3   ETS1靶向结合XIST激活其转录

为探索ETS1的下游机制，我们检索了PROMO数据库，发现ETS1可能与XIST启动子序列结合，见图3A；cBioPortal数据库结果显示，在胶质瘤组织中XIST与ETS1 mRNA的表达呈正相关，见图3B。通过双荧光素酶报告基因实验验证ETS1与XIST的结合关系，结果显示在U87和LN229细胞系中，过表达ETS1均可显著提高XIST WT报告质粒的荧光素酶活性，见图3C。在U87和LN229细胞系中使用ETS1特异性抗体进行ChIP-qPCR检测进一步证实二者的结合关系，结果表明与IgG对照组相比，ETS1抗体可以显著富集XIST的启动子序列，见图3D。将si-ETS1#1、si-ETS1#2转染进U87和LN229细胞系中，qRT-PCR结果显示与对照组相比，敲低ETS1可显著降低XIST的表达，见图3E。此外，qRT-PCR结果显示，XIST在胶质瘤组织中高表达，见图3F；且Pearson分析发现在胶质瘤组织中XIST与ETS1 mRNA的表达呈正相关，见图3G；qRT-PCR结果显示，与正常细胞相比，XIST在胶质瘤细胞中表达上调，见图3H。这些数据表明，ETS1可靶向结合XIST促进其表达。

图  3  ETS1靶向结合XIST

Figure  3  ETS1 targeted XIST

**: P<0.01; ***: P<0.001; A: PROMO database predicted the binding site of ETS1 to the XIST promoter; B: cBioPortal database was used to analyze the correlation between ETS1 mRNA and XIST expression in glioma tissues; C: dual-luciferase reporter assay was conducted to examine the effect of ETS1 overexpression on the luciferase activity of XIST-WT and XIST-MUT; D: ChIP-qPCR was used to detect the binding of ETS1 to the XIST promoter region; E: qRT-PCR was utilized to detect the expression level of XIST in U87 and LN229 cells after transfection with si-ETS1#1 or si-ETS1#2; F: qRT-PCR was used to detect the expression level of XIST in 58 glioma tissues and adjacent tissues; G: Pearson correlation analysis was performed on the expression of ETS1 mRNA and XIST in glioma tissues; H: the expression level of XIST in glioma cell lines and NHA cells was detected by qRT-PCR.

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2.4   过表达XIST可逆转敲低ETS1对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

为进一步证实ETS1是否通过调控XIST促进胶质瘤细胞的增殖，我们将si-ETS1#1和XIST过表达质粒共转染U87和LN229细胞系，并通过qRT-PCR验证转染效率，见图4A。转染成功后，CCK-8和EdU实验结果显示，与单独转染si-ETS1#1组相比，共转染si-ETS1#1和XIST组中胶质瘤细胞增殖能力显著提高，见图4B、C。Western blot实验结果显示，与单独转染si-ETS1#1组相比，共转染si-ETS1#1和XIST组细胞中Bax、Bak的表达水平显著降低，而Bcl-2的表达显著升高，见图4D。结果表明过表达XIST可部分逆转敲低ETS1对胶质瘤细胞增殖的抑制作用，以及对细胞凋亡的促进作用，EST1可以依赖XIST调控胶质瘤细胞的增殖和凋亡。

图  4  过表达XIST可逆转敲低ETS1对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

Figure  4  Overexpression of XIST reversed the effect of ETS1 knockdown on the proliferation and apoptosis of glioma cells

*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; A: qRT-PCR was used to detect the expression level of XIST in U87 and LN229 cells after co-transfection of si-ETS1#1 and XIST; B: CCK-8 assay was performed to detect the activity of U87 and LN229 cells after co-transfection of si-ETS1#1 and XIST; C: EdU assay was used to detect the proliferation of U87 and LN229 cells after co-transfection of si-ETS1#1 and XIST; D: Western blot was employed to detect the expression levels of apoptosis-related proteins in U87 and LN229 cells after co-transfection of si-ETS1#1 and XIST.

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3   讨论

转录因子是一种DNA结合蛋白，通过结合特定区域来调节基因的表达^[16]。长期以来，由于转录因子主要定位于细胞质和细胞核，除了配体诱导的核受体外，转录因子曾被认为是“不可成药”的靶点^[17]。近年，很多研究发现特异性小分子可以阻断转录因子和DNA、蛋白质的相互作用，有些化合物可以诱导转录因子通过泛素化降解，这些发现为靶向转录因子治疗肿瘤开辟了新的可能性^[18]。

最近的几项研究表明转录因子ETS1可参与胶质瘤的进展。如ETS1通过结合在SNHG10启动子区域促进其转录，从而上调FBXL19的表达，最终促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭^[14]；PAXIP1-AS1通过募集ETS1上调KIF14的表达，从而促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭以及血管生成^[19]。ETS1能作为果糖1,6二磷酸酶基因的转录抑制因子抑制其表达，介导糖酵解和肿瘤细胞侵袭迁移^[20]。还有研究发现ETS1在胶质母细胞瘤衍生的内皮和间充质干细胞样细胞中高表达，且其表达与胶质母细胞瘤的侵袭性以及微血管密度相关^[21]。本研究中，我们发现ETS1在胶质瘤组织和细胞系中高表达，且其高表达与胶质瘤患者不良临床病理指标有关。另外，敲低ETS1可显著抑制胶质瘤细胞的增殖，并促进细胞凋亡。我们的研究结果与既往的报道^[14,19-21]均提示，ETS1可能成为胶质瘤的潜在治疗靶点。

本研究证实了ETS1可与XIST的启动子结合。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，大量研究表明lncRNAs可参与多种疾病的发生发展^[22-24]。XIST是lncRNA之一，研究发现其可调控肿瘤细胞的恶性表型^[25]。XIST已被证实在许多肿瘤中上调，如在结直肠癌中，XIST充当致癌因子，通过抑制miR-132-3p的表达促进癌细胞的增殖^[26]；甲状腺癌中，XIST在癌组织和细胞系中均显著上调，并通过调控miR-34a和MET/PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖^[27]；非小细胞肺癌中，XIST在患者组织样本中高表达，敲低XIST可抑制癌细胞的生长，并促进肿瘤细胞对顺铂的敏感度^[28]。研究表明XIST在胶质瘤中上调，且通过miR-133a/SOX4轴促进细胞的增殖和转移^[15]；还有研究发现过表达XIST可通过调控miR-329/CREB1轴促进胶质瘤细胞增殖、侵袭，并抑制细胞凋亡及降低癌细胞的放射敏感度^[29]；敲低XIST可通过上调miR-204-5p的表达，进而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，从而抑制胶质瘤的进展^[30]。本研究中，同样发现XIST在胶质瘤组织和细胞中显著上调，且生物信息学分析显示在胶质瘤组织中ETS1与XIST的表达呈正相关，且XIST的转录受ETS1调控，过表达XIST可部分逆转敲低ETS1对胶质瘤细胞恶性表型的抑制作用。本研究为XIST在胶质瘤中的异常表达提供了一种合理的解释。

总之，本研究证实ETS1在胶质瘤组织中高表达并与患者不良临床病理指标相关，过表达ETS1可以促进XIST的转录，这表明ETS1在胶质瘤进展中发挥潜在促癌作用。