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腹腔镜近端胃癌根治术消化道重建的历史与现状

王道荣, 王伟

王道荣, 王伟. 腹腔镜近端胃癌根治术消化道重建的历史与现状[J]. 肿瘤防治研究, 2022, 49(7): 644-648. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1353
引用本文: 王道荣, 王伟. 腹腔镜近端胃癌根治术消化道重建的历史与现状[J]. 肿瘤防治研究, 2022, 49(7): 644-648. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1353
WANG Daorong, WANG Wei. History and Current Situation of Digestive Tract Reconstruction After Laparoscopic Proximal Radical Gastrectomy[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7): 644-648. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1353
Citation: WANG Daorong, WANG Wei. History and Current Situation of Digestive Tract Reconstruction After Laparoscopic Proximal Radical Gastrectomy[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7): 644-648. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1353

腹腔镜近端胃癌根治术消化道重建的历史与现状

基金项目: 

国家自然科学基金 81972269

详细信息
    作者简介:

    王道荣  医学博士,教授,博士生导师,主任医师,扬州大学-扬州市普通外科研究所所长,扬州大学肿瘤研究所副所长,江苏省重点学科、重点专科普通外科学科带头人,扬州大学附属苏北医院普通外科/胃肠外科/胃肠肿瘤MDT主任,国家级普通外科专科医师规培基地主任,国家级腹腔镜外科医师培训基地主任,江苏省333工程第二层次培养对象(领军人才)、六大人才高峰培养对象,扬州市医学会普通外科专业委员会主委,江苏省医师协会结直肠肿瘤专委会副主任委员,中华医学会外科分会营养支持学组委员,中国医疗保健国际交流促进会胃肠外科分会常委,中国研究型医院学会肿瘤外科专业委员会委员,中国研究型医院协会机器人与腹腔镜专业委员会委员,江苏省普外科质控专家组专家。主持国家自然科学基金面上项目三项、江苏省省级课题六项,获江苏省医学新技术引进奖四项、江苏省医学科技奖二项。发表SCI论文40余篇。
    王道荣(1966-),男,博士,教授,主任医师,主要从事胃肠外科治疗研究,E-mail: wdaorong666@sina.com

  • 中图分类号: R730.56;R735.2

History and Current Situation of Digestive Tract Reconstruction After Laparoscopic Proximal Radical Gastrectomy

Funding: 

National Natural Science Funding of China 81972269

  • 摘要:

    世界范围内的近端胃癌发生率逐年升高,根治性胃切除仍是其治疗的主要方法。随着腹腔镜微创技术的发展,保留部分胃功能的腹腔镜下近端胃切除近年来备受关注。因肿瘤位置的特殊性,消化道重建方式的选择仍存在争议,本文对目前的腹腔镜近端胃癌根治术后消化道重建方式进行综述,为临床医师合理选择消化道重建方式提供参考。

     

    Abstract:

    The incidence of proximal gastric cancer worldwide is increasing year by year, and radical gastrectomy is still the main treatment. Partial function preserving in laparoscopic proximal gastrectomy has been continuously concerned in recent years, with the development of laparoscopic minimally invasive technology. However, the choice of digestive tract reconstruction is still controversial, due to the specificity of tumor location. This article reviews the current digestive tract reconstruction after laparoscopic proximal gastrectomy, and provides some references for clinicians to choose the digestive tract reconstruction methods rationally.

     

  • 前列腺癌(prostate cancer)是全球男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,是男性第五大癌症死因[1-2]。据统计,随着人口老龄化的加剧我国50岁及以上年龄前列腺癌的发病率正不断上升[3]。目前,有关前列腺癌发生发展的分子机制包括:Myc上调、NKX3.1下调、PTEN的突变或缺失、miRNA调节、TMPRSS2-ERG易位以及一些信号通路的失调[4-6]

    环状RNA是真核生物中共价闭合的内源性生物分子,通过外显子或内含子环化在3’和5’末端连接,形成完整的环状结构,这种特殊的结构赋予其比线性RNA更高的稳定性[7-10]。研究发现,环状RNA的表达失调与多种癌症发生发展相关,如结直肠癌[11]、肺癌[12]、胃癌[13]、膀胱癌[14]等。最新研究报道了前列腺癌中广泛和功能性的circRNA[15-16]。在前期预实验中,我们通过RNA深度测序后,发现hsa_circ_0001922与前列腺癌转移高度相关,然而,目前尚未报道hsa_circ_0001922在前列腺癌中的作用。本研究旨在探索hsa_circ_0001922对前列腺癌PC-3细胞生物学功能的影响以及分子机制,以期为前列腺癌的临床治疗提供新靶标和新思路。

    人前列腺癌PC-3细胞株购于ATCC细胞库、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1购于中国上海中科院细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶、EDGS、Keratinocyte-SFM购于美国Gibco公司;qRT-PCR引物购于武汉赛维尔公司;反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒均购于日本TaKaRa公司;RNAFISH试剂盒、探针及siRNA购于广州锐博公司;Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司;Transwell小室购于美国Millipore公司;基质胶购自美国BD公司;BCA全蛋白提取试剂盒购于中国索莱宝公司;Western blot抗体购于中国Proteintech公司。

    PC-3细胞为贴壁细胞,用含10%FBS的RPMI1640培养基进行常规培养,待细胞生长到80%,用0.25%胰酶进行传代用于后续研究。RWPE-1细胞用特殊培养基(EDGS 5 ml和Keratinocyte-SFM 500 ml混匀)进行培养,待细胞生长至80%,用0.05%胰酶进行传代用于后续研究。

    采用TRIzol法提取细胞总RNA,按反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒操作,以GAPDH为内参基因,以2-ΔΔCt法对结果进行分析。引物序列见表 1

    表  1  引物序列
    Table  1  Primer Sequence
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    使用Ribo Fluorescent In Situ Hybridzation Kit试剂盒。细胞培养:将细胞爬片置于24孔板底,培养适量细胞,实验前使细胞融合度达到60%~70%,注意爬片与底板间不要产生气泡。细胞固定和通透:PBS清洗细胞5 min,4%多聚甲醛室温固定10 min后PBS清洗细胞5 min,共3次;每孔加入1 ml预冷的通透液(含0.5%Triton X-100的PBS),4℃静置5 min,弃去通透液后,加入PBS清洗细胞5 min,3次。探针检测:每孔加入200 μl预杂交液,37℃封闭30 min,将杂交液在37℃中预热,避光条件下,将2.5 μl 20 μmol/L探针加入到100 μl杂交液中,弃去预杂交液,加入100 μl含有探针的探针杂交液,避光,37℃杂交过夜,避光,42℃,杂交液1(4×SSC,0.1%Tween-20)清洗细胞3次,每次5 min,以降低背景信号,避光,42℃;杂交液2(2×SSC)清洗细胞1次,避光,42℃;杂交液3(1×SSC)清洗细胞1次,避光,PBS清洗细胞,室温5 min;DNA染色:避光,1×DAPI染色液染色10 min,避光下PBS清洗细胞3次,每次5 min。封片:避光条件下,从孔中取出细胞爬片,用封片剂将其固定于载玻片上,进行荧光检测。

    利用siRNA有效敲低PC-3中hsa_circ_0001922的表达,设计两条特异性siRNA分子,序列分为si-hsa_circ_0001922(1):CATTTGGCAGAGATCGTAA;si-hsa_circ_0001922(2):GCAGAGATCGTAAAGCTGA。siRNA转染分组:PC-3+si-NC、PC-3+si-hsa_circ_0001922(1)、PC-3+si-hsa_circ_0001922(2)。其中si-NC为阴性对照组。按照siRNA说明书设置四组浓度:33、50、100和150 nmol/L。当细胞生长至30%~40%时进行转染。以24孔板为例,首先取1.5 ml EP管,管中加入Opti-MEM和Lipofectamine2000,混匀后静置5 min;加siRNA、siNC混匀,静置20 min;将培养板中的培养基换成无FBS的基本培养基;混匀液滴加至24孔板中,轻微晃动培养板,置于培养箱中培养,4~6 h后换含FBS的培养基。48 h后进行qRT-PCR和Western blot实验。

    转染后消化各实验组细胞并用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬,调整细胞密度,使六孔板每孔接种1 000个细胞并置于37℃、5%CO2的培养箱培养两周,待形成肉眼可见的单克隆后终止培养。PBS冲洗细胞,每孔加入1 ml 4%的多聚甲醛,于4℃固定1 h后吸弃,每孔加入1 ml结晶紫染色10 min后吸弃染料,并用流水轻轻冲洗,室温晾干后拍照保存结果。以上实验重复三次。

    转染后的PC-3细胞接种至24孔板,待细胞过夜贴壁长至80%后弃培养液,用200 μl无菌枪头进行划痕,并于0、6和24 h在显微镜下观察拍照。Image J软件计算细胞的迁移面积百分比。以上实验重复三次。

    将Matrigel基质胶和RPMI1640培养基以1:5比例稀释后滴加至Transwell小室的上室,振荡混匀后置于37℃培养箱凝固过夜。取对数期生长的PC-3细胞进行相应转染处理后重悬于无血清的RPMI1640培养基中,调整合适细胞密度为2.5×105个/毫升,吸取200 μl细胞悬液加至上室,下室加入600 μl含15%FBS的RPMI1640培养基。常规培养48~72 h后,取出Transwell小室,吸弃培养液,用棉签轻轻擦净上室细胞,PBS冲洗三次,4%多聚甲醛固定20 min,室温晾干后用结晶紫染色15 min,流水轻轻冲洗,室温晾干后于显微镜下观察并拍照,随机观察5个视野,Image J软件计数穿膜细胞的数目。上述实验重复三次。

    总蛋白的提取:按索莱宝全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,并采用BCA法测定蛋白浓度。100℃加热10 min使蛋白质变性。10%分离胶进行SDS-PAGE电泳,半干法PVDF膜转移蛋白。5%的脱脂奶粉于摇床室温封闭2 h,TBST洗涤3次后,分别加入E-cadherin(1:5 000)、Vimentin(1:2 000)一抗,4℃过夜,隔天TBST洗涤3次,每次10 min,孵育对应的二抗1.5 h,TBST洗涤3次,加入显色液曝光。使用Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

    采用GraphPad软件进行统计分析,两组样本比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

    qRT-PCR检测结果显示,与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比,前列腺癌PC-3细胞中hsa_circ_0001922表达水平显著上升,差异有统计学意义(1.03 vs. 4.34, P=0.003)。RNA FISH实验发现,Cy3标记hsa_circ_0001922探针的荧光大部分存在于细胞质中,少部分定位于细胞核,见图 1

    图  1  RNA FISH实验表明hsa-circ-0001922存在于前列腺癌PC-3细胞质和细胞核中
    Figure  1  RNA FISH experiments showed that hsa_circ_0001922 existed in cytoplasm and nucleus of prostate cancer PC-3 cells

    当si-hsa_circ_0001922浓度为100 nmol/L时,抑制效果最好(P < 0.05),见图 2

    图  2  不同浓度siRNA对hsa_circ_0001922表达的抑制效果
    *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with si-NC group.
    Figure  2  Inhibitory effect of different concentrations of siRNA on hsa_circ_0001922 expression

    根据上述结果,选择100 nmol/L si-hsa_circ_0001922转染细胞做进一步实验。平板克隆形成实验结果显示,与si-NC组相比,转染了si-hsa_circ_0001922的PC-3细胞克隆数下降,差异有统计学意义(P=0.0058, P=0.0087);Transwell侵袭实验结果表明,转染si-hsa_circ_0001922抑制了PC-3细胞侵袭能力(P=0.0183, P=0.0121);24 h划痕实验结果显示,转染si-hsa_circ_0001922组PC-3迁移的速度下降(P=0.0046, P=0.0009),见图 3

    图  3  敲低hsa_circ_0001922对前列腺癌PC-3细胞增殖(A)、侵袭(B)和迁移(C)的影响
    *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with si-NC group.
    Figure  3  Effect of hsa_circ_0001922 knockdown on proliferation(A), invasion(B) and migration(C) of prostate cancer PC-3 cells

    综上结果,si-hsa_circ_0001922(2)敲低效果较好,因此收集转染si-hsa_circ_0001922(2)的PC-3细胞,并提取RNA和蛋白质。实验结果显示,敲低hsa_circ_0001922使E-cadherin mRNA表达水平升高,Vimentin mRNA表达水平下降(均P < 0.05)。进一步蛋白免疫印迹结果显示敲低hsa_circ_0001922后,E-cadherin的蛋白水平上升(P=0.0085),Vimentin的蛋白水平下降(P=0.0089),见图 4

    图  4  敲低hsa_circ_0001922对PC-3细胞EMT相关基因mRNA(A)和蛋白(B)表达的影响
    *: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with si-NC group.
    Figure  4  Effects of hsa_circ_0001922 knockdown on mRNA(A) and protein(B) expression of EMT-related genes in PC-3 cells

    有研究表明,预计到2030年,发展中国家以及亚洲地区65岁以上人群的前列腺癌发病率将急剧上升[17]。因此,阐明前列腺癌的进展机制对于发现前列腺癌的防治极其重要。

    虽然雄激素受体(AR)途径对PCa的进展有重要作用[18],然而,多种非AR依赖性途径在PCa进展中的作用也不容忽视。目前已经发现,环状RNAs表达异常与多个肿瘤发生发展相关。例如:Zeng等[19]报道了circANKS1B在三阴性乳腺癌中显著上调,并通过诱导上皮间质转化促进乳腺癌的侵袭和转移。Wei等[20]研究显示,相对于健康肺组织,circPTPRA在非小细胞肺癌中显著下调,较低水平的circPTPRA与NSCLC转移和较差的生存结果相关。

    本研究发现,hsa_circ_0001922表达在前列腺癌细胞PC-3中显著升高。hsa_circ_0001922是由HUWE1的外显子反向剪接而成,其在细胞中的作用目前尚未见报道。进一步研究发现,敲低hsa_circ_0001922后,PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降。与对照组相比,PC-3细胞克隆数、迁移和侵袭细胞数显著下降(P < 0.05),并初步证实,hsa_circ_0001922这一作用可能是通过促进EMT进程实现的。Li等[21]报道了hsa_circ_0016068通过miR-330-3p/BMI-1途径信号增强PCa细胞的增殖和侵袭能力。Feng等[22]也证实来源于XIAP的hsa_circ_RNA0005276通过与FUS结合蛋白相互作用激活XIAP的转录,进而促进PCa细胞增殖、迁移和转移。

    在前列腺癌进展过程中,上皮细胞可以经历上皮间质转化,导致细胞间黏附丧失,从而使癌细胞迁移或转移到不同的器官[23]。而前列腺癌转移是大多数前列腺癌患者死亡的关键因素[24]

    本研究发现敲低hsa_circ_0001922后,E-cadherin的表达水平上调,Vimentin的表达水平下调。上皮标志物E-cadherin在细胞间起着黏附的作用,而间充质标志物Vimentin是中间丝的其中一种蛋白质,能调节细胞骨架内蛋白间的相互作用。在癌症进展过程中,E-cadherin的丢失以及Vimentin的增加,加强了癌细胞与原始肿瘤块的分离和侵袭性[25],最终造成癌症转移。

    综上,本研究证实了环状RNA调控EMT进程是前列腺癌进展的重要一环。hsa_circ_0001922在PC-3生长和转移中发挥关键作用,这一作用可能是通过促进PC-3细胞EMT进程实现的。未来将进一步证实hsa_circ_0001922作为miRNA的海绵,或者直接结合EMT相关蛋白的方式来影响EMT进程的分子机制。

    Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.
    作者贡献:
    王道荣:手术操作及指导,论文审校
    王伟:围手术期准备,论文写作
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-21
  • 修回日期:  2022-03-20
  • 网络出版日期:  2024-01-12
  • 刊出日期:  2022-07-24

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