0   引言

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）恶性程度高，易出现早期复发和内脏转移，是乳腺癌中侵袭性最强，预后最差的亚型^[1]。由于缺乏特异性治疗靶点，内分泌治疗和靶向治疗基本无效，化疗仍是晚期TNBC主要的治疗手段。TNBC早期对化疗相对敏感，但随着治疗推进，患者逐渐产生耐药，导致治疗失败及预后不良。接受常规化疗的转移性TNBC患者的中位总生存期仅9~12月^[2]。此外，化疗带来的不良反应如心脏毒性、神经毒性、胃肠道反应、骨髓抑制等也不容小觑，严重影响患者生活质量^[3]。因此，研发新型抗肿瘤药物是一个亟待解决的难题。

中医药是临床抗癌治疗的重要组成部分，具有多途径、多靶点、多通路的协同抗肿瘤特点，可逆转肿瘤化疗耐药、提高机体免疫功能、抑制肿瘤远处转移^[4-5]。槲皮素是一种广泛存在于多种中草药（白花蛇舌草、黄芩、三七）中的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等药理作用^[6-7]。研究表明，槲皮素可通过抑制肿瘤细胞增殖、转移及诱导凋亡等多种途径来发挥抗肿瘤作用^[7]。其中，细胞凋亡是诸多抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的重要途径。文献证实槲皮素在宫颈癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤中可通过促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用^[8-10]。槲皮素的促凋亡作用涉及多种分子和信号通路，如通过内质网应激途径诱导宫颈癌细胞凋亡^[8]；通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases, PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（RAC-α serine/threonine-protein kinase, AKT）信号通路促进肺腺癌细胞凋亡等^[9]。TNBC中，槲皮素是否也通过诱导凋亡发挥抗肿瘤作用也是本研究探索的目的。

JAK2/STAT3信号通路是细胞内重要信号转导通路，通过影响下游多种效应分子的活化状态，参与调控肿瘤发生、发展等多个环节^[11]。研究表明富含黄酮物质的中药可抑制JAK2/STAT3通路发挥抗肿瘤作用。甘草总黄酮抑制 JAK2/STAT3通路可减小异种移植乳腺癌肿瘤体积^[12]。槲皮素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路促进直肠癌细胞和卵巢癌细胞凋亡^[13-14]。这些研究为我们深入探索槲皮素在TNBC中的促凋亡机制提供了新的思路。本课题组前期利用叶酸修饰构建脂质体槲皮素（folic acid-modified liposome quercetin, FLQ）^[15]，克服了槲皮素水溶性差、靶向性不足、生物利用度低等问题，旨在探索叶酸修饰脂质体槲皮素是否通过JAK2/STAT3信号通路促进TNBC细胞线粒体途径凋亡，为叶酸修饰脂质体槲皮素应用于临床TNBC治疗提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   细胞系及主要试剂

人三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM试剂盒、胎牛血清、胰酶和青/链霉素均购自美国Gibco公司；细胞周期检测试剂盒、线粒体膜电位试剂盒和ROS检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂及5×蛋白上样缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；ECL发光试剂盒购自美国Advansta公司；JAK2抗体（74987）、STAT3抗体（30835）、p-JAK2抗体（4406）和p-STAT3抗体（9145）均购自美国Cell Signaling Technology公司；细胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）抗体（ab133504）和Cleaved-Caspase-3抗体（ab2302）均购自英国Abcam公司；Bcl2抗体（68103-1-Ig）、Bcl-x_L抗体（26967-1-AP）、Bax抗体（50599-2-Ig）、Bak抗体（29552-1-AP）、GAPDH抗体（60004-1-Ig）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠（SA00001-1）和山羊抗兔（SA00001-2）二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2   实验方法

1.2.1   细胞培养

将人三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）置于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培养基中，在含5%CO₂、37℃恒温培养箱中培养，待细胞融合至80%~90%进行传代。

1.2.2   叶酸修饰脂质体槲皮素的制备

将槲皮素与卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、聚乙二醇混合，再与氯仿混合后溶解于二甲基亚砜中，经真空干燥、水合反应、超声波破碎和微孔滤膜过滤，得到槲皮素脂质体，与N, N-羰基二咪唑和吡啶混合搅拌后加入三乙胺，避光反应6 h后加入含叶酸的二甲基亚砜溶液，再避光反应24 h后加入冰乙醚，抽滤得到滤饼后溶于丙酮，过滤再旋转蒸发至半干状，真空干燥备用，进行细胞实验室时用DMSO溶解，再用完全培养基稀释成需要的浓度。

1.2.3   CCK-8法检测FLQ对TNBC细胞活力的影响

取对数生长期的MDA-MB-231细胞，按3×10³/孔接种于96孔板内，24 h后更换为不同浓度的FLQ（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L），分别于FLQ处理后48 h，按照CCK-8试剂盒说明书，向每孔加入100 µl检测液，置于培养箱中孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值，选择合适的FLQ浓度进行后续实验。细胞活力（%）=（A_实验孔－A_空白孔）/（A_对照孔－A_空白孔）×100%。

1.2.4   克隆形成实验检测FLQ对TNBC细胞增殖能力的影响

取对数生长期的MDA-MB-231细胞消化离心（1 000 r/min, 5 min），按200个/孔接种于6孔板内，分为对照组和FLQ组，对照组用0.1%的DMSO处理，FLQ组用20 μmol/L的FLQ处理，置于细胞培养箱中连续培养14天，终止培养后，用甲醛固定后结晶紫染色，计数>50个细胞的克隆数。

1.2.5   流式细胞术检测FLQ对TNBC细胞凋亡的影响

取对数生长期的MDA-MB-231细胞消化离心，按3×10⁵/孔接种于6孔板内，分为对照组和FLQ组，对照组用0.1%的DMSO处理，FLQ组用20 μmol/L的FLQ处理，置于细胞培养箱中培养48 h，收集细胞，预冷的PBS冲洗，1 200 r/min，离心5 min，弃上清液，100 μl Binding buffer制细胞悬液，依次加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，室温避光孵育15 min。加入400 μl Binding buffer混悬细胞后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6   流式细胞术检测FLQ对TNBC细胞内ROS水平的影响

按照1.2.5分组给药处理细胞48 h，收集细胞，PBS冲洗，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，加入100 μl稀释好的DCFH-DA探针，37℃避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.2.7   流式细胞术检测FLQ对TNBC细胞线粒体膜电位的影响

按照1.2.5分组给药处理细胞48 h，收集细胞，PBS冲洗，每孔加入1 ml培养基+1 ml JC-1工作液，充分混匀后37℃孵育20 min，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，1×JC-1染色缓冲液洗涤，最后加入适量JC-1染色缓冲液冲悬后，流式细胞仪检测线粒体膜电位。

1.2.8   Western blot检测JAK2/STAT3信号通路及凋亡相关蛋白的表达

取对数生长期的MDA-MB-231细胞以4×10⁵个/孔接种于6孔板内，分为对照组和FLQ组，对照组用0.1%的DMSO处理，FLQ组用20 μmol/L的FLQ处理，48 h后提取总蛋白，BCA定量法定量后，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃水浴使蛋白变性。每孔20 μg进行蛋白凝胶电泳，湿法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光液，凝胶成像采集系统采集凝胶图像，Image J软件进行后续分析。

1.3   统计学方法

SPSS 23.0和Graphpad 9.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示。两独立样本间的比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   FLQ对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用

为检测FLQ对MDA-MB-231细胞活性的影响，我们使用不同浓度的FLQ作用于MDA-MB-231细胞48 h后，CCK-8检测细胞活性。结果显示：FLQ可抑制MDA-MB-231细胞活性，并且药物浓度越大，抑制作用越强，呈现剂量依赖性，见图1；FLQ作用于MDA-MB-231的IC₅₀为20.69 μmol/L，因此，采用20 μmol/L的FLQ浓度作用48 h进行后续实验。

图  1  FLQ对MDA-MB-231细胞活力的影响

Figure  1  Effect of FLQ on MDA-MB-231 cell viability

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2.2   FLQ对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

与对照组相比，FLQ处理组克隆数量明显减少（P=0.023），说明FLQ可以抑制MDA-MB-231细胞增殖，图2。

图  2  FLQ对MDA-MB-231细胞增殖的影响

Figure  2  Effect of FLQ on MDA-MB-231 cell proliferation

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2.3   FLQ诱导MDA-MB-231细胞凋亡

与对照组相比，FLQ处理组细胞凋亡显著，细胞凋亡率明显升高（P<0.001），说明FLQ可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡，见图3。

图  3  FLQ对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

Figure  3  Effect of FLQ on MDA-MB-231 cell apoptosis

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2.4   FLQ促进MDA-MB-231细胞线粒体膜电位坍塌

线粒体膜电位下降是凋亡的早期表现，一旦线粒体膜电位损耗，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。我们用JC-1染料检测了MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的变化。流式细胞术检测结果显示：对照组细胞线粒体膜电位处于较高水平，FLQ处理组细胞线粒体膜电位处于较低水平，两组差异有统计学意义（P=0.003），见图4。提示FLQ对线粒体功能有不利影响，导致MDA-MB-231细胞线粒体膜电位坍塌。

图  4  FLQ对MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的影响

Figure  4  Effect of FLQ on the mitochondrial membrane potential of MDA-MB-231 cells

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2.5   FLQ促进MDA-MB-231细胞ROS生成

与对照组相比，FLQ处理组生成绿色DCFH荧光信号的细胞比例明显升高（P=0.034），见图5，表明FLQ促进MDA-MB-231细胞内ROS的生成。

图  5  FLQ对MDA-MB-231细胞内ROS水平的影响

Figure  5  Effect of FLQ on the intracellular ROS levels of MDA-MB-231 cells

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2.6   FLQ通过靶向JAK2/STAT3信号通路促进MDA-MB-231细胞凋亡

Western blot检测JAK2/STAT3信号通路中相关蛋白t-JAK2、p-JAK2、t-STAT3、p-STAT3及凋亡相关蛋白Bcl2、Bcl-x_L、Bax、Bak、Cyt C、Cleaved-Caspase-3表达。结果显示：与对照组相比，FLQ处理组p-JAK2、p-STAT3表达量明显降低（P<0.001），但t-JAK2、t-STAT3的表达量无明显变化；促凋亡蛋白Bax、Bak、Cyt C、Cleaved-Caspase-3表达量明显升高（P<0.001），而抗凋亡蛋白Bcl2、Bcl-x_L表达量明显降低（P=0.037，0.028），见图6。

图  6  FLQ对JAK2/STAT3信号通路活性及凋亡相关蛋白表达的影响

Figure  6  Effect of FLQ on the activity of the JAK2/STAT3 signaling pathway and expression levels of apoptosis-related proteins

ns: no significant; *: P<0.05; ***P<0.001.

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3   讨论

TNBC是雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌，约占所有乳腺癌的10%~15%。由于缺乏有效的治疗靶点，TNBC的治疗一直极具挑战性。尽管目前探索TNBC潜在治疗靶点的研究较多，但一直未有突破性进展。TNBC仍缺乏特异有效的治疗药物，整体预后较差^[16]。近年来，中药在肿瘤治疗中因其高效低毒的特点受到了越来越多的关注。不断有研究证实中药单体成分可通过调节多种生物学过程，发挥抗肿瘤作用^[17-18]。

槲皮素作为多种中药的黄酮类成份，具有多靶点和不易耐药的优势，可以通过调节多种信号通路靶点蛋白抑制肿瘤的发生和发展进程，还可逆转化疗耐药、增加放疗敏感性^[19-20]。但槲皮素水溶性较差、代谢较快、半衰期较短，生物利用度较低的特点，限制了其在临床上的使用^[21]。近年来，纳米靶向给药体系的研究发展迅速， 将传统的抗肿瘤药物分子以包埋、吸附、囊封或者共价键合的形式，结合在具有纳米尺度的载体上（如脂质体、胶束、纳米粒等），可以一定程度上提高药物溶解性，增加药物的靶向性，延长药物体内循环时间^[22]。

基于肿瘤微环境对纳米载体进行有效的表面修饰，可进一步提高药物的靶向递送效率。叶酸是一种小分子维生素，具有无毒、无免疫原性、生物相容性好、结构稳定性高、易于合成与修饰等优点^[23]。叶酸受体是一种N-糖基化蛋白，与叶酸有很高的结合亲和力，包括乳腺癌在内的许多肿瘤细胞表面高度表达，但在正常组织中表达水平非常低^[24]。在肿瘤治疗中利用叶酸与其受体的特异性结合，能将药物聚集于肿瘤部位，同时减少对正常细胞的毒性，显著增加疗效^[25]。

基于此，本研究将槲皮素包载在脂质体中，并用叶酸加以修饰，构建了FLQ，赋予其肿瘤靶向性，在提高其在体内的生物利用度的同时降低全身的不良反应^[15]。不受控制的细胞增殖和逃避细胞凋亡是肿瘤的两大特征，抑制增殖和诱导凋亡成为治疗肿瘤的重要途径。本研究结果显示，FLQ可抑制TNBC细胞MDA-MB-231增殖，并呈浓度依赖性；还可促进MDA-MB-231细胞凋亡。

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要分子途径，线粒体膜电位降低是其发生的特征性标志^[17]。本研究中，FLQ可诱导MDA-MB-231细胞线粒体膜电位坍塌，并上调细胞内ROS水平，提示FLQ可能诱导线粒体凋亡途径。线粒体凋亡途径主要受Bcl-2家族蛋白调控。Bcl-2家族蛋白由促凋亡蛋白（Bax等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2等）构成，Bcl-2与Bax构成异源二聚体，维持线粒体外膜的完整性，阻止线粒体凋亡反应。在凋亡信号刺激下，Bcl2/Bax比值的发生变化，导致线粒体膜电位降低及通透性增加，释放Cyt C，激活下游Caspase级联反应，启动线粒体凋亡途径^[17]。本研究中，FLQ下调Bcl2/Bax比值以及上调Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达，进一步说明FLQ通过诱导线粒体凋亡途径而发挥体外抗TNBC作用。

大量研究表明，JAK2/STAT3信号通路在多种肿瘤中异常活化，发挥其促进肿瘤生长、转移、增强耐药及免疫逃逸的作用。JAK2、STAT3是该通路主要效应子。胞外信号与受体胞外域结合后，激活JAK2并使之磷酸化，随后p-JAK2磷酸化其下游底物STAT3，p-STAT3发生二聚化并转移到细胞核，在细胞核内调节基因转录^[26]。既往研究发现，抑制JAK2/STAT3信号通路可诱导肝癌细胞经线粒体途径凋亡，提示该通路参与调控线粒体凋亡通路^[27]。本研究结果显示，FLQ显著降低JAK2、STAT3磷酸化水平，同时显著上调Bcl2表达而下调Bax表达，说明FLQ通过作用JAK2/STAT3信号通路而激活线粒体凋亡途径。

综上所述，本研究证实FLQ抑制TNBC细胞MDA-MB-231细胞增殖并诱导其凋亡，阐明FLQ通过靶向JAK2/STAT3信号通路而激活线粒体凋亡途径的分子机制，揭示了FLQ抗TNBC的科学内涵，为FLQ的药效发挥提供理论依据。