0   引言

卵巢癌是一个突出的公共卫生问题，尽管其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中低于宫颈癌及子宫内膜癌，但死亡率占据妇科恶性肿瘤之首^[1]。根据世界卫生组织的统计，每年新增病例约225 500例，卵巢癌死亡的病例约140 200例左右^[2]。1980年以来，卵巢癌的5年总生存率仍低于30%，未见明显改善^[3]。因此探讨卵巢癌的发病机制，寻找新的治疗策略，成为女性健康领域的重大诉求。

乳脂肪球表皮生长因子8（milk fat globule-EGF factor 8, MFG-E8），又称为乳凝集素，是一种分泌型糖蛋白，由MFG-E8基因编码^[4]，其在许多生理和病理过程中发挥重要作用，如吞噬作用、动脉粥样硬化的发病机制、血管生成、免疫保护以及其他^[5-8]。已有研究证实MFG-E8在多种肿瘤中高表达，并可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭等^[9-13]，但MFG-E8在卵巢癌中的研究较少^[14]。前期实验中，我们已经证实沉默MFG-E8可抑制上皮性卵巢癌细胞增殖、影响细胞周期分布、迁移、黏附、侵袭等生物学特性，并对其相关机制进行了探讨。有研究显示在肿瘤干细胞标记阳性的黑素瘤、乳腺癌以及非小细胞肺癌细胞株中证实MFG-E8可激活Stat3和Sonic Hedgehog信号途径，与IL-6协同增强其抗癌药耐药性^[15]，但其对于卵巢癌细胞化疗抵抗的影响尚不明确。本研究通过探讨沉默MFG-E8基因对卵巢癌SKOV3细胞顺铂药物敏感度的影响及其相关作用机制，为上皮性卵巢癌靶向治疗提供新思路。

1   材料与方法

1.1   材料

SKOV3细胞购自中科院上海细胞库。引物由上海生工合成，MFG-E8 siRNA及NC siRNA由江苏吉玛生物公司构建并合成。RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司、细胞培养瓶和多孔培养板均购自美国Corning公司、CCK-8增殖试剂盒购自美国MCE公司、E-cadherin兔抗人单克隆抗体、N-cadherin兔抗人单克隆抗体、Vimentin兔抗人单克隆抗体、Snail+Slug兔抗人多克隆抗体以及GAPDH兔抗人单克隆抗体均购自美国Abcam公司、蛋白酶抑制剂、BCA检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒均购自武汉塞维尔公司。Lipofectamine™2000购自美国Invitrogen公司、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购于日本TaKaRa公司、顺铂购自山东齐鲁药业有限公司（H20073653）。

1.2   细胞培养及转染

SKOV3细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下常规培养，1~2天换液一次。

MFG-E8 siRNA以及阴性对照siRNA（NC siRNA）序列如下：MFG-E8 siRNA#1：正义（5’-3’）GAUUUCCCAAGAAGUGCGATT，反义（5’-3’）UCGCACUUCUUGGGAAAUCTT；MFG-E8 siRNA#2：正义（5’-3’）GGACACGAAUU-CGAUUUCATT，反义（5’-3’）UGAAAUCGAAUUCGUGUCCTT；MFG-E8 siRNA#3：正义（5’-3’）GGCCUGAAGAAUAACAGCATT，反义（5’-3’）UGCUGUUAUUCUUCAGGCCTT；NC siRNA：正义（5’-3’）UUCUUCGAACGUGUCACGUTT，反义（5’-3’）ACGUGACACGUUCGGAGAATT。转染前一天，用胰酶消化细胞并计数，将细胞铺入六孔板中，使转染时细胞汇合度达到50%~70%，此时用不含抗生素的培养基进行培养，第二天进行细胞转染。转染步骤参考Lipofectamine™2000的试剂说明进行。步骤如下：（1）分别将2 μg NC siRNA或转染组MFG-E8 siRNA #1、#2、#3、5 μl Lipofectamine^TM2000溶于250 μl Opti-MEMⅠ培养基中，室温孵育5 min。（2）将上述siRNA与Lipofectamine™2000混合，室温下继续孵育20 min。（3）将500 μl上述混合物分别加入各孔细胞中，轻轻混悬。转染6~8 h后更换含10%血清的完全培养基继续培养至48 h。收集细胞用于后续的研究。

1.3   MFG-E8 siRNA转染对细胞的顺铂药物毒性影响

取对数生长期的SKOV3细胞，常规胰酶消化，离心后用RPIM 1640培养基（含10%胎牛血清）重悬为单细胞悬液，计数板计数后，按每孔1×10⁵个/孔接种于6孔板内，每组设6个复孔，置于5%CO₂、37℃的培养箱内培养24 h，第二天用NC siRNA和MFG-E8 siRNA分别转染细胞。于转染后24 h，分别加入使用浓度为0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5 μg/ml顺铂作用于各组细胞，继续置于培养箱内培养48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μl，孵育2 h，应用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值（OD），根据以下公式计算细胞相对增殖抑制率。

相对增殖抑制率（%）=1－[（实验孔OD值－空白孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）]×100%。本研究空白孔为单纯培养基。GraphPad Prism 5.0统计软件计算各组细胞顺铂注射液的IC₅₀，选取适宜的药物浓度进行后续试验。

1.4   CCK-8检测MFG-E8 siRNA转染后细胞对顺铂的反应

取SKOV3细胞单细胞悬液，计数后将1×10⁵个/孔细胞均匀接种于96孔板中。贴壁12 h后，用NC siRNA和MFG-E8 siRNA转染细胞，方法同前，每组设6个复孔。转染后24 h，分别加入顺铂（药物浓度为上述实验中检测顺铂对阴性对照组细胞的IC₅₀值）继续培养。分别在加药24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK-8，继续培养2 h，利用多功能酶标仪测定各个孔在450 nm处的OD值。

1.5   实时荧光定量PCR实验

按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，并对所提取的RNA完整性鉴定和定量，反转录合成cDNA，SYBR®GreenⅠ行Real-time PCR检测，50℃适应2 min，94℃预变性5 min，94℃变性15 s，60℃复性、延伸45 s，循环40次。每次延伸前读板。95℃反应10 min后作溶解曲线分析。以GAPDH作为内参基因，分析目的基因的mRNA相对表达量。

1.6   Western blot实验

加入细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，湿转法电转印蛋白质至PVDF膜，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶封闭液中，封闭2 h，将膜放置于含有一抗的稀释液中，4℃过夜，加入二抗（1:500）室温孵育2 h，将等体积的化学发光试剂A和B混匀后与PVDF膜共孵育1 min，应用Image Quant LAS 4000凝胶成像系统进行显色，Gelpro4.0软件分析条带灰度值，蛋白相对表达量=待检样品蛋白的灰度值/内参的灰度值。

1.7   统计学方法

所有实验结果均采用均数±标准差（x±s）表示，GraphPad Prism5.0统计软件处理，t检验对数据进行统计分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   沉默MFG-E8基因转染效率测定结果

分别将NC siRNA及MFG-E8 siRNA转染SKOV3细胞中，于转染后48 h收集细胞检测MFG-E8 siRNA的干扰效率，Vehicle（溶剂组）只加转染试剂Lipofectamine^TM2000。

Western blot结果显示，MFG-E8蛋白的表达在MFG-E8 siRNA#3中明显低于MFG-E8 siRNA#1、MFG-E8 siRNA#2以及组Vehicle组和NC siRNA组细胞，其中NC siRNA组相对蛋白量为0.85±0.106，MFG-E8 siRNA组相对蛋白量为0.28±0.079（P=0.0003），见图 1。上述结果表明所用MFG-E8 siRNA#3序列可以有效干扰MFG-E8的表达，阴性序列对MFG-E8蛋白表达无明显影响，因此应用MFG-E8 siRNA#3（Msi）及NC siRNA（Csi）完成后续试验。

图  1  转染后48 h各组细胞中MFG-E8蛋白的表达

Figure  1  Expression of MFG-E8 protein in SKOV3 cells after MFG-E8 siRNA transfection for 48h

Csi: NC siRNA group; Msi: MFG-E8 siRNA group.

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2.2   CCK-8检测MFG-E8 siRNA转染对SKOV3细胞顺铂毒性的影响

不同浓度的顺铂作用于两组细胞48 h后结果显示，随着药物浓度的增高，两组细胞的增殖抑制率均有上升，MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖抑制率上升较明显（P=0.0001），见图 2A。GraphPad Prism 5.0统计软件计算顺铂对两组细胞的IC₅₀，MFG-E8 siRNA转染组（3.308±1.75）明显低于对照组（1.934±0.06），差异有统计学意义（P=0.0002）。

图  2  CCK-8检测顺铂对两组SKOV3细胞的毒性反应

Figure  2  Toxicities reaction of cisplatin in two groups of SKOV3 cells detected by CCK-8

A: cell growth rate was evaluated using CCK-8 assay in SKOV3 cells transfected with MFG-E8 siRNA(Msi) or NC siRNA(Csi), followed by different concentration of Casplatin treatment for 48h respectively; B: cell growth rate was evaluated using CCK-8 assay in SKOV3 cells transfected with MFG-E8 siRNA(Msi) or NC siRNA(Csi), followed by 3μg /ml Casplatin treatment for 24h, 48h and 72h, respectively.

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据所测阴性对照组的IC₅₀，将3 μg/ml顺铂浓度作用于两组细胞，检测不同时间后两组细胞对顺铂的敏感度变化。结果表明，处理48、72 h后，可见MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖活性显著低于阴性对照组，见图 2B、表 1。

表  1  FG-E8 siRNA转染联合顺铂(3 μg/ml) 对细胞增殖的影响

Table  1  Influence of MFG-E8 siRNA t ransfection combined with casplatin (3μg/ml) on proliferation of SKOV3 cells

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2.3   qRT-PCR检测MFG-E8 siRNA对多重耐药蛋白ABCB1、ABCC1 mRNA水平表达的影响

结果显示，与阴性对照组相比，MFG-E8 siRNA转染组中ABCB1及ABCC1 mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P=0.0059, P=0.0206），见图 3。

图  3  qRT-PCR检测两组细胞中耐药基因ABCB1、ABCC1 mRNA相对表达水平

Figure  3  ABCB1 and ABCC1 mRNA expression in SKOV3 cells of two groups detected by qRT-PCR

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2.4   MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞中EMT进程的影响

Csi与Msi组中N-Cadherin mRNA表达量分别为1.01±0.073和0.72±0.086，差异有统计学意义（P=0.002），Snail mRNA表达量分别为1.06±0.072和0.71±0.032，差异有统计学意义（P=0.000）；Vimentin mRNA相对表达量分别为1.03±0.181和0.60±0.122，差异有统计学意义（P=0.0469）；E-Cadherin mRNA相对表达量分别为0.92±0.087和1.69±0.2371，差异有统计学意义（P=0.001）。说明沉默MFG-E8基因可下调N-Cadherin、Vimentin、Snail mRNA的表达，上调E-Cadherin mRNA表达，见图 4。

图  4  qRT-PCR检测转染MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞中EMT的影响

Figure  4  Effect of MFG-E8 siRNA transfection on EMT in SKOV3 cells detected by qRT-PCR

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Western blot检测结果显示，Csi组与Msi组N-Cadherin蛋白的相对表达量为0.67±0.03和0.47±0.013，差异有统计学意义（P=0.020）；snail+slug蛋白相对表达量分别为0.33±0.02和0.12±0.017，差异有统计学意义（P=0.0002）；Vimentin蛋白相对表达量分别为0.53±0.081和0.27± 0.062，差异有统计学意义（P=0.0258）；E-Cadherin蛋白相对表达量分别为0.27±0.033和0.61±0.034，差异有统计学意义（P=0.0085）。结果表明，沉默MFG-E8可降低SKOV3细胞中N-Cadherin、Vimentin、Snail+Slug蛋白的表达，上调E-Cadherin蛋白表达，见图 5。

图  5  Western blot检测转染MFG-E8 siRNA对SKOV3细胞中EMT相关蛋白表达的影响

Figure  5  Effect of MFG-E8 siRNA transfection on expression of EMT-related proteins in SKOV3 cells detected by Western blot

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3   讨论

尽管随着治疗技术的进展，手术及联合放化疗等治疗手段广泛应用于临床，但中晚期的上皮性卵巢癌患者病死率仍无明显改善。卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中死亡率最高，其恶性进展的特征包括：腹腔内肿瘤细胞的扩散，大量腹水的快速形成，肿瘤血管的形成^[16]。认识卵巢癌的发病机制，寻找更有效的治疗方案，是关乎女性健康的一大挑战。

MFG-E8可从各种类型的细胞中分泌，包括乳腺上皮细胞、巨噬细胞和未成熟的树突细胞，并通过与吞噬细胞上的αVβ3整合素结合来介导凋亡细胞的有效吞噬作用^[17-18]，已有研究证实MFG-E8可促进肿瘤增殖、侵袭^{[5, 9]}。

化疗是上皮性卵巢癌的主要治疗手段之一，尤其是对中晚期患者来说。本研究进一步检测了MFG-E8 siRNA转染对SKOV3细胞顺铂毒性反应以及联合顺铂处理对细胞增殖的影响。结果显示，随着药物浓度的增高，各组细胞的增殖抑制率上升，MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖抑制率上升明显，当顺铂浓度达到7.5 μg/ml以上时，两组细胞OD值趋于接近，参考顺铂对阴性对照组细胞的IC₅₀，设定药物浓度为3 μg/ml作用于两组细胞，测不同的时间点（24、48、72 h）对抗肿瘤药物敏感度的变化。结果显示处理48、72 h后，MFG-E8 siRNA转染组细胞增殖活性显著低于阴性对照联合顺铂处理组细胞。提示MFG-E8参与了卵巢癌耐药的发生过程。

虽然一线化疗（铂类联合）对大多数卵巢癌患者在初始治疗时疗效显著，但大约70%的晚期卵巢癌患者会在治疗后复发，并最终因化疗耐药而导致死亡。有研究表明，MFG-E8可以促进肿瘤细胞对化疗的耐药性^[15]，ABCB1（P-gp MDR1）以及ABCC1（MRP1）均属于为ATP结合盒（ATP binding cassette transporters）转运蛋白超家族成员，广泛分布于肿瘤组织内，与多重耐药相关^[19]。研究发现，多重耐药分子机制复杂，涉及多个方面，如肿瘤细胞对化疗药物的摄取降低、排出增加、以及机体对药物代谢的改变、DNA损伤修复增强等，但其具体机制尚不明确。ATP结合盒转运蛋白具有“药泵”作用，它可以将化疗药物从肿瘤细胞内泵出，降低细胞内有效药物浓度，从而产生耐药。为进一步了解MFG-E8基因对多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1的影响，我们用qRT-PCR检测MFG-E8 siRNA对ABCB1及ABCC1 mRNA表达变化，结果显示，与阴性对照组相比，MFG-E8 siRNA转染组中ABCB1及ABCC1 mRNA表达均明显降低。这表明沉默MFG-E8对顺铂的增敏作用可能是通过降低ABCB1及ABCC1表达产生。

越来越多的研究表明上皮间充质细胞转化（epithelial mesenchymal transtion, EMT）激活可促进肿瘤组织的侵袭、远处转移及肿瘤耐药^[20-21]。EMT是指上皮性细胞失去细胞极性转化为间质细胞的过程，间充质细胞可表现出更高的侵袭性及迁移性等恶性表型^[22]。EMT在各种病理过程中同样发挥着重要作用，包括伤口愈合、组织纤维化和癌症进展^[20-21]。EMT被分为三型：1型EMT指在胚胎发育阶段上皮细胞转化为运动间充质细胞；2型涉及伤口愈合和组织再生；3型发生在上皮性肿瘤细胞中与肿瘤进展和转移密切相关^[23]。EMT的形成体现在上皮性标志物E-cadherin蛋白表达降低，同时伴有N-cadherin、Vimentin、Snail及Slug蛋白表达升高^[24]。本研究同时检测沉默MFG-E8基因表达在mRNA水平及蛋白水平对EMT进程的影响，结果显示MFG-E8 siRNA可上调E-cadherin表达，同时抑制N-cadherin、Vimentin、Snail及Slug表达，证实沉默MFG-E8基因可逆转SKOV3细胞中的EMT形成过程。我们的结果与MFG-E8在恶性黑色素瘤及结直肠癌中的作用研究结果一致^{[5, 25]}。

综上，本研究提示在沉默MFG-E8基因可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感度，并下调多重耐药蛋白ABCB1及ABCC1 mRNA水平的表达，说明MFG-E8与化疗耐药相关，并且沉默MFG-E8可抑制EMT进程。这将为表达MFG-E8的卵巢癌的治疗提供新思路。