Inhibition of Antimicrobial Peptide 17BIPHE2 on Lung Adenocarcinoma A549 Cells and Related Mechanism
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摘要:目的
探讨抗菌肽17BIPHE2对人肺腺癌细胞A549的抑制作用及其作用机制。
方法MTT法检测0~40 μmol/L的抗菌肽17BIPHE2对A549细胞增殖的影响；流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡情况；Real-time PCR和Western blot检测Bax、Bcl-2的表达变化；透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。
结果17BIPHE2可抑制A549细胞的增殖，其IC50值为34.33 μmol/L，同时20、25、30、35、40 μmol/L的17BIPHE2对A549细胞的生长抑制率分别为（1.8±2.7）%、（6.1±2.1）%、（24.6±4.6）%、（55.2±1.1）%、（76.3±1.2）%。与对照组相比，25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24h的A549细胞凋亡率显著增高（P < 0.05），细胞核呈现固缩，染色质深染，线粒体嵴断裂，内质网肿胀等凋亡细胞的特征。Bax的表达上调（P < 0.05），Bcl-2的表达受到抑制（P < 0.05），Bax/Bcl-2比值升高。
结论17BIPHE2可能是通过上调Bax表达，下调Bcl-2表达诱导A549细胞凋亡，抑制其增殖。
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关键词:
- 抗菌肽17BIPHE2 /
- 肺腺癌 /
- A549细胞 /
- 凋亡
Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibition of antimicrobial peptide 17BIPHE2 on lung adenocarcinoma A549 cells and the related mechanism.
MethodsThe viabilities of A549 cells treated with 17BIPHE2(0-40μmol/L) were measured by MTT method; flow cytometry and TUNEL were used to observe cell apoptosis; Real-time PCR and Western blot were used to measure the expression of Bax and Bcl-2. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure change of A549 cells.
ResultsMTT results showed that 17BIPHE2 could inhibit the proliferation of A549 cells, and the IC50 was 34.33μmol/L. The inhibitory rates at different concentrations (20, 25, 30, 35 and 40μmol/L) of 17BIPHE2 was (1.8±2.7)%, (6.1±2.1)%, (24.6±4.6)%, (55.2±1.1)% and (76.3±1.2)%, respectively. The apoptosis rates of A549 cells treated with 17BIPHE2 (25, 35μmol/L) for 24h were significantly higher than that of the control group(P < 0.05); the nucleus of A549 presented karyopyknosis, hyperchromatin mitochondrial crest fracture, endoplasmic reticulum swelling and other characteristics of apoptosis. Real-time PCR and Western blot results showed that 17BIPHE2 significantly upregulated Bax expression(P < 0.05) and downregulated Bcl-2 expression(P < 0.05) respectively, and the ratio of Bax/Bcl-2 was upregulated.
ConclusionAntimicrobial peptide 17BIPHE2 may induce the apoptosis and suppress the proliferation of A549 cells by upregulating Bax expression and downregulating Bcl-2 expression.
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Key words:
- Antimicrobial peptide 17BIPHE2 /
- Lung adenocarcinoma /
- A549 cells /
- Apoptosis
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0 引言
抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是广泛存在于生物体内、由特定基因编码、具有抵御外界微生物侵害及清除体内突变细胞作用的一类小分子多肽，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分[1]。LL-37是抗菌肽Cathelicidin家族中唯一存在于人体的抗菌肽，主要由中性粒细胞、各种上皮细胞产生，是固有免疫的重要组成部分，其主要功能为抗细菌、真菌、病毒及寄生虫感染及抑制肿瘤增殖，同时也参与适应性免疫调节[2-4]。
由于LL-37有37个氨基酸，故在化学合成过程中合成成本增高且出错的几率增大，因此寻找肽链更短、活性较好的LL-37衍生肽成为研究热点。17BIPHE2是LL-37的衍生肽，由美国内布拉斯加医学中心王广顺教授设计合成，前期研究发现17BIPHE2可抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MARS）及其生物被膜[5]，但其能否抑制肿瘤还不得而知。
因此我们设计并进行相关实验以观察抗菌肽17BIPHE2对人肺腺癌细胞A549的作用并探讨相关的作用机制，通过研究发现17BIPHE2可上调A549细胞的Bax并下调Bcl-2的表达，从而诱导细胞凋亡，抑制其增殖，以期为将17BIPHE2开发为抗肿瘤新药物提供理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人肺腺癌细胞A549细胞由宁夏医科大学总医院干细胞研究所提供。
1.1.2 LL-37衍生肽17BIPHE2
氨基酸序列GBKRLVQRLKDBLRNLV由上海吉尔生化采用固相化学法合成，纯度（HPLC）≥95%，并于-20℃保存备用，ddH2O作为抗菌肽溶剂。紫杉醇购自哈药生物工程公司。
1.1.3 试剂
RPMI1640培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（德国PAN-Biotech GmbH公司）；Bax、Bcl-2单克隆抗体（美国Abcam公司）；β-actin单克隆抗体、HRP-山羊抗兔-IgG（北京博奥森生物技术有限公司）；TRIzol Regant（美国Invitrogen公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物有限公司）；TUNEL凋亡检测试剂盒（瑞士Roche公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；SYBR Select Master Mix（美国Applied Biosystem公司）；二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）、青霉素链霉素混合液等化学试剂购置于北京Solarbio公司；所用引物由上海生物工程股份有限公司合成。
1.1.4 仪器
Thermo Forma 310型CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Step one荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Multiskan GO酶标仪、Nanodrop 2000核酸浓度测定仪（美国Thermo Scientific公司）；XDS-500D倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；BD Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）；Hitachi-H7650透射电子显微镜（日本日立株式会社）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肺腺癌细胞549在含有10%胎牛血清、1×105 μmol/L青霉素和链霉素双抗的RPMI1640培养液中，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖
将处于对数生长期的A549细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，37℃培养过夜。选择浓度为0、20、25、30、35、40 μmol/L的17BIPHE2处理24 h（处理组），以不含17BIPHE2组为阴性对照（空白组），10 μmol/L的紫杉醇为阳性对照（对照组），每组设4个复孔。处理完成后，弃去培养液，每孔加入50 μl MTT（5 g/L）溶液于37℃避光孵育4 h。孵育完成后每孔加入150 μl DMSO溶液，于酶标仪检测490 nm波长处吸光度值（A值），计算细胞存活率。计算公式：细胞存活率（%）=（A处理组－A空白组）/（A对照组－A空白组）× 100%。实验重复3次。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡
收集对数生长期的A549细胞1×108个每毫升，接种于6孔板内，5%CO2、37℃恒温箱培养过夜。加入浓度分别为0、25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h，弃去培养液，PBS洗涤2次，加入不含EDTA的胰酶消化3 min后收集细胞，加入400 μl的Annexin V结合液重悬细胞，使其浓度大约为1×106个每毫升。在细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混匀后4℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染液4℃避光孵育5 min流式细胞仪进行检测。
1.2.4 TUNEL染色观察细胞凋亡
收集对数生长期的A549细胞1×108个每毫升，接种于铺有无菌盖玻片的6孔板内，5%CO2、37℃恒温箱培养过夜。加入浓度分别为0、25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h，弃去培养液，PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛室温固定1 h，PBS清洗3次，加入3%的H2O2，室温封闭10 min，PBS冲洗玻片3次，加入0.1% Triton-X100柠檬酸钠通透液孵育2 min，PBS冲洗3次，加入TUNEL反应液，37℃避光加湿环境孵育60 min，PBS洗涤3次，加入POD转换液37℃避光加湿孵育30 min，PBS漂洗3次，加入DAB底物在20℃下孵育10 min，PBS漂洗3次，滴加甘油封片，在普通光学显微镜下进行分析。
1.2.5 Real-time PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA水平的表达变化
培养A549细胞大约至80%~90%时，加入0、25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h。处理完成后收集5×106个细胞，加入1 ml TRIzol提取总RNA，再反转录为cDNA，-20℃保存备用。SYBR Select Master Mix试剂盒检测mRNA的表达变化，GAPDH作为内参。Real-time PCR引物为：Bax上游引物：5'-GGAAGAAGATGGGCTGAGG-3；下游引物：5'-TGTGTCCCGAAGGAGGTTTA-3；Bcl-2：上游引物：5'-CCGGATCACCATCTGAAGA-3；下游引物：5'-CAGGGCAAAGAAATGCAAGT-3；GAPDH：上游引物：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3；下游引物：5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3。Real-time PCR 20 μl反应体系包括：10 μl SYBR Select Master Mix、7 μl H2O、1 μl上游引物、1 μl下游引物和1 μl模板。95℃ 10 min预热激活DNA聚合酶，PCR扩增条件为95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，95℃ 15 s，共40个循环。
1.2.6 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达变化
将A549细胞培养于T25透气细胞培养瓶中，加入浓度分别为0、25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h，收集5×106个细胞。提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取60 μg总蛋白的裂解上清液，进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。之后将凝胶转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤膜3次，每次5 min，然后分别与Bax、Bcl-2、β-actin单克隆抗体（1:1 000）4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5 000）室温孵育1 h，用超敏ECL化学发光试剂盒于Image Quant LAS4000 min超灵敏化学发光成像仪上曝光，以β-actin作为内参。
1.2.7 透射电镜观察细胞超微结构变化
收集0、25、35 μmol/L 17BIPHE2处理24 h的A549细胞5×106个，采用3%戊二醛溶液室温固定1 h。PBS冲洗3次，每次15 min，加入1%锇酸浸泡1 h，后PBS漂洗2次，每次15 min。经30%乙醇4℃脱水10 min，50%乙醇4℃脱水10 min，70%乙醇4℃脱水10 min，80%乙醇室温脱水10 min，90%乙醇室温脱水10 min，100%乙醇室温脱水2次，每次15 min，梯度脱水后，用环氧树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。
1.3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验均重复3次，所得数据以（x±s）表示，组间两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 17BIPHE2抑制A549细胞的增殖
采用MTT的方法检测抗菌肽17BIPHE2和非小细胞肺癌临床化疗药物紫杉醇对A549细胞的生长抑制情况，见图 1。20、25、30、35、40 μmol/L的17BIPHE2和10 μmol/L的紫杉醇分别处理A549细胞24 h后，A549细胞的生长抑制率分别为（1.8±2.7）%、（6.1±2.1）%、（24.6±4.6）%、（55.2±1.1）%、（76.3±1.2）%和（35.9±4.5）%，与对照组相比，17BIPHE2从25 μmol/L的作用浓度即可显著抑制A549细胞的增殖（P < 0.05），其IC50为34.33 μmol/L。35 μmol/L的17BIPHE2对A549细胞的增殖抑制作用超过10 μmol/L的紫杉醇。说明抗菌肽17BIPHE2在体外能够显著抑制A549细胞的增殖。
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图 1 抗菌肽17BIPHE2和紫杉醇抑制A549细胞增殖Figure 1 17BIPHE2 and paclitaxel inhibited proliferation of A549 cells*: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with control group (paclitaxel group)2.2 17BIPHE2促进A549细胞凋亡
随着17BIPHE2浓度升高，A549细胞的凋亡率逐渐上升，与对照组相比，25、35 μmol/L 17BIPHE2处理的A549细胞，早期凋亡细胞百分率差异有统计学意义（P < 0.05），而死细胞的比例处理组与对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。35 μmol/L 17BIPHE2处理的A549细胞，晚期凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01），以上结果表明17BIPHE2可促进A549细胞凋亡，见表 1、图 2。
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图 2 流式细胞术检测不同浓度17BIPHE2对A549细胞凋亡的影响Figure 2 Apoptosis rates of A549 cells treated with different concentrations of 17BIPHE2 observed by flow cytometry1: dead cells; 2: late apoptotic cells; 3: early apoptotic cells; 4: living cells表 1 不同浓度17BIPHE2处理A549细胞24 h后的细胞凋亡率(n=3, x±s, %)Table 1 Cell apoptosis rates of A549 cells treated with different concentrations of 17BIPHE2 for 24 h (n=3, x±s, %)
2.3 TUNEL染色检测17BIPHE2诱导A549细胞凋亡情况
对照组细胞核呈圆形，染色质分布均匀，细胞核为棕色均匀淡染，而25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h的A549细胞，细胞核固缩呈块状，染色质致密深染片段化，表现为典型的凋亡细胞形态学特征，与对照组相比，随着药物浓度的升高，凋亡细胞的比例显著提高（P < 0.01），见图 3。
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图 3 TUNEL染色检测17BIPHE2诱导的A549细胞凋亡Figure 3 Apoptosis of A549 cells induced by 17BIPHE2 observed by TUNEL staining assay*: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with control group2.4 17BIPHE2在mRNA水平上调A549细胞Bax、下调Bcl-2的表达
25、35 μmol/L的17BIPHE2作用于A549细胞24 h后，Real-time PCR分别检测Bax、Bcl-2在mRNA水平上的表达变化，结果显示，与对照组相比17BIPHE2可上调Bax的表达（P < 0.05），下调Bcl-2的表达（P < 0.05），Bax/Bcl-2的比值升高，与17BIPHE2浓度呈依赖性，见图 4。
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图 4 17BIPHE2对A549细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响Figure 4 Effect of 17BIPHE2 on Bax mRNA and Bcl-2 mRNA expression in A549 cells*: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with control group2.5 17BIPHE2在蛋白水平上调A549细胞Bax、下调Bcl-2的表达
25、35 μmol/L的17BIPHE2作用于A549细胞24 h后，Western blot检测Bax、Bcl-2在蛋白水平上的表达变化，结果显示，与对照组相比17BIPHE2可上调Bax的表达（P < 0.05），下调Bcl-2的表达（P < 0.05），Bax/Bcl-2的比值升高，与17BIPHE2浓度呈依赖性，见图 5。
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图 5 17BIPHE2对A549细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Figure 5 Effect of 17BIPHE2 on Bax and Bcl-2 protein expression in A549 cells*: P < 0.05, compared with control group2.6 抗菌肽17BIPHE2破坏A549细胞的超微结构
对照组A549细胞，胞质内细胞器清晰，有大量的线粒体，线粒体嵴结构清晰完整，并可见大量的粗面内质网及游离核糖体，细胞核内染色体分布均匀，核仁清晰。而用25 μmol/L的17BIPHE2处理的A549细胞，胞质内空泡增多，核皱缩，线粒体嵴轻度破坏其它细胞器轻微破坏。35 μmol/L的17BIPHE2处理的A549细胞，胞质内细胞器结构破坏，线粒体嵴断裂、内质网肿胀变空，见图 6。
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图 6 透射电子显微镜观察17BIPHE2对A549细胞超微结构的影响Figure 6 Effect of 17BIPHE2 on ultrastructure of A549 cells observed by transmission electron microscopy3 讨论
LL-37是先天性宿主免疫效应中的一个重要分子，Oren等通过截肽的活性来鉴定负责LL-37抗微生物作用的最小区域，结果发现：LL-37第17-29或第18-29位氨基酸是这个最小区域[6-7]。17BIPHE2是LL-37的衍生肽，氨基酸序列为GBKRLVQRLKDBLRNLV（L为D型氨基酸，B为联苯苯丙酸）[8]，与LL-37对比17BIPHE2具有较强的抗菌活性，能够抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MARS）[9]，对金黄色葡萄球菌形成的生物被膜也有很好的抑制作用[5]。但抗菌肽17BIPHE2对肿瘤细胞的作用少有报道。
LL-37通过调控自然杀伤细胞调节的细胞毒性对肿瘤细胞有杀伤作用[10-12]，目前许多研究报道LL-37能够抑制多种肿瘤细胞如结直肠癌[13]、白血病[14]、膀胱癌[15]细胞的增殖。本研究中，首先观察了17BIPHE2对人肺腺癌细胞A549的细胞毒作用。MTT实验显示，17BIPHE2对A549细胞有增殖抑制作用（P < 0.05），随着浓度的增高抑制效果增强，在一定浓度范围内呈浓度依赖性，其半数抑制浓度为34.33 μmol/L。
LL-37抑制肿瘤细胞增殖的作用多是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。Mader等[14]在白血病的研究中证明，LL-37可使凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor, AIF）从线粒体移位到细胞核引起DNA损伤，并依赖钙蛋白酶（calpain）上调Bax诱导Jurkat细胞非caspase依赖的凋亡，抑制白血病细胞。Ren等[13]证实，LL-37作用于结直肠癌细胞可使凋亡诱导因子、核酸内切酶G（endonuclease G, EndoG）从线粒体移位到细胞核使DNA片段化激活P53及其下游蛋白，上调Bax，下调Bcl-2，诱导结直肠癌细胞非caspase依赖的凋亡。潘文瑞[15]发现，LL-37可诱导膀胱肿瘤细胞发生凋亡抑制增殖。Ren等[16]还发现，LL-37的衍生肽FK16能激活p53及其下游蛋白，上调Bax，下调Bcl-2，诱导结直肠癌细胞凋亡和自噬，抑制结直肠肿瘤细胞增殖。
形态学的改变是判断凋亡的基础，主要特点有染色质固缩、DNA片段化、线粒体肿胀或是出现凋亡小体[17-18]。本研究中TUNEL染色和透射电子显微镜结果显示，17BIPHE2处理的A549细胞核呈固缩，染色质深染，线粒体嵴断裂，内质网肿胀等细胞凋亡的形态特征。流式细胞检测25、35 μmol/L 17BIPHE2处理的A549细胞早期凋亡率较对照组显著增多（P < 0.05），当17BIPHE2浓度达到35 μmol/L时A549细胞晚期凋亡率较对照组显著增高（P < 0.01）。由此推断诱导肿瘤细胞凋亡可能是17BIPHE2抑制A549细胞增殖的机制。
在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用。Bcl-2家族可以分为两大类，一类是促细胞调亡的，主要包括Bax、Bak、Bcl-xS、Bad、Bid等，另一类是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Mcl-1等[19]。其中Bax和Bcl-2往往成比例存在，Bax的表达上调能够拮抗Bcl-2抑凋亡的效应，当Bax/Bcl-2比例上升时，细胞线粒体膜电位（Δψ m）发生改变，线粒体内cytc释放出来激活caspase3使细胞发生凋亡[20]。本研究中经25、35 μmol/L的17BIPHE2处理24 h的A549细胞，Bax的表达较对照组上调（P < 0.05），Bcl-2的表达下调（P < 0.05），Bax/Bcl-2的比值升高。因此17BIPHE2可能是通过上调Bax，下调Bcl-2促进A549细胞凋亡。
综上所述，17BIPHE2对A549细胞的增殖有显著的抑制作用，其抑制肿瘤细胞增殖的机制可能是上调Bax表达、下调Bcl-2表达促进肿瘤细胞凋亡。这一机制的发现为进一步研究17BIPHE2的抗肿瘤机制提供了实验依据，也为将17BIPHE2开发为新型抗肿瘤药物提供了一个可能的方向。
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图 1 抗菌肽17BIPHE2和紫杉醇抑制A549细胞增殖
Figure 1 17BIPHE2 and paclitaxel inhibited proliferation of A549 cells
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图 2 流式细胞术检测不同浓度17BIPHE2对A549细胞凋亡的影响
Figure 2 Apoptosis rates of A549 cells treated with different concentrations of 17BIPHE2 observed by flow cytometry
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图 3 TUNEL染色检测17BIPHE2诱导的A549细胞凋亡
Figure 3 Apoptosis of A549 cells induced by 17BIPHE2 observed by TUNEL staining assay
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图 4 17BIPHE2对A549细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响
Figure 4 Effect of 17BIPHE2 on Bax mRNA and Bcl-2 mRNA expression in A549 cells
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图 5 17BIPHE2对A549细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
Figure 5 Effect of 17BIPHE2 on Bax and Bcl-2 protein expression in A549 cells
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图 6 透射电子显微镜观察17BIPHE2对A549细胞超微结构的影响
Figure 6 Effect of 17BIPHE2 on ultrastructure of A549 cells observed by transmission electron microscopy
表 1 不同浓度17BIPHE2处理A549细胞24 h后的细胞凋亡率(n=3, x±s, %)
Table 1 Cell apoptosis rates of A549 cells treated with different concentrations of 17BIPHE2 for 24 h (n=3, x±s, %)
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