0   引言

肺癌已成为发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一^[1]。据统计2016年美国新发肺癌共224 390例，占新发癌症的14%。肺癌导致的死亡共158 080例，因肺癌导致的死亡所占比例中男女均占首位，分别为27%和26%^[2]。癌症转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，因而迫切需要建立合适的肺癌转移动物模型研究肺癌的发病机制，预防策略及药物治疗等相关方面。理想的肺癌动物模型应能模拟出肺癌发生、进展、侵袭和转移，同时能够评价不同药物对不同类型肺癌的临床治疗效果^[3]。小鼠因其容易饲养、繁殖率高等优点，成为科研中最常用的实验动物^[4]。本文就实验动物选择不同部位转移模型建立方法及其在科研领域中的应用进展作一综述。

1   转移动物的选择

建立肿瘤模型首先应解决宿主动物的免疫排斥反应，因此免疫缺陷动物是最佳的异种移植受体。免疫缺陷动物易受细菌、病毒等感染，需在无特定病原体级（specific pathogen free, SPF）条件下饲养。通常实验小鼠雌雄兼用，周龄在4周~10周之间，体质量14~22 g^[5-7]。以下介绍五种免疫缺陷小鼠，分别为裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠和NSG小鼠。

1.1   裸鼠

第一个用来分析人类肿瘤生长的免疫缺陷动物模型是Foxn1基因突变的纯合子裸鼠。尽管裸鼠存在T细胞免疫缺陷，但是它们具有完整的B细胞免疫，并且自然杀伤细胞的活性高^[8]。

1.2   SCID小鼠

1980年培育出缺乏成熟T、B细胞免疫的SCID（重症联合免疫缺陷小鼠）。由于VDJ的重排，SCID小鼠缺乏功能性T细胞和B细胞，这使得它们优于裸鼠，更适合用于研究人类移植瘤，但这种小鼠可能逐渐产生成熟的T细胞和B细胞，即渗漏现象^[9]。

1.3   NOD/SCID小鼠

为进一步减少固有免疫，同时提高人类造血细胞以及其他细胞移植成功率，将NOD小鼠与SCID小鼠回交培育出NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷）小鼠。与SCID小鼠相比，NOD/SCID小鼠缺乏固有免疫，自然杀伤细胞相应减少，缺少异抗体^[10]，因此它有更高的移植成功率。然而NOD/SCID小鼠的存活时间较短，平均存活期为37周，这是由于NOD/SCID小鼠易自发淋巴瘤，主要是胸腺淋巴瘤^[11]。

1.4   NOG小鼠

2002年Ito等将NOD/SCID小鼠与γ-链IL-2受体敲除的小鼠杂交得到NOG（NOD/Shi-SCID IL2rgtm1sug/Jic）小鼠^[12]。此种小鼠固有免疫和适应性免疫系统均严重受损，缺乏T、B细胞，并且完全缺乏NK细胞，缺乏补体活性^[13]。

1.5   NSG小鼠

NSG（NOD/LtSz-SCID IL2rgtm1Wjl/Szj）小鼠各方面均与NOG小鼠类似，缺乏T、B细胞免疫，固有免疫的功能也进一步减弱，同时完全缺乏自然杀伤细胞^[14]。由于IL-2γ的敲除，抑制了自发性胸腺淋巴瘤的产生，NSG和NOG小鼠的寿命长于SCID小鼠中位生存期约90周，NSG小鼠极大的提高了人类细胞和组织的移植成功率^[12]，更适合进行各种实验研究。

2   转移模型的构建

转移是肺癌恶性的标志。肺癌转移是肺癌患者生存率低的重要原因^[15]，最常见的肺癌远处转移为骨转移和脑转移，转移率分别为30%~40%^[16]和25%~40%^[17]。

常见的肺癌小鼠模型有自发性模型、化学诱导模型、移植模型和转基因模型，而移植模型是最常用的动物模型。使用不同方法构建转移模型对细胞数量、注射部位、实验小鼠的选择均有差异^[3]。构建转移模型的细胞数量为10³~10^9[18-20]，注射部位多选择皮下、腋下、肋缘下、尾静脉、左心室、原位注射、转移部位注射^{[6, 19-23]}。本文主要介绍移植模型的制备方法。

2.1   肺癌原位转移

构建肺癌原位转移最能模拟出肿瘤生长的微环境。主要有3种方法构建肺癌原位转移模型，分别为支气管内注射、肺内注射和尾静脉注射。

由于支气管内注射操作困难，成瘤率低，因此其应用受到限制。目前应用较为广泛的是肺内注射和尾静脉注射。刘菲等^[20]将浓度分别为1×10⁵、5×10⁵个小鼠肺腺癌细胞（lewis lung cancer, LLC）按1:1的比例混悬于Matrigel中，取100 μl，接种于C57BL/6小鼠左肺内。术后小鼠中位生存时间分别为37.5、24.5天，成瘤率均为100%。实验发现当原位接种细胞数为1×10⁵个时，小鼠模型稳定，更适合长期观察。Deng等^[21]将10⁷个A549细胞混悬于200 μl RPMI 1640培养液中制成单细胞悬液经尾静脉注射至6周龄的雌性裸鼠体内，4周后解剖小鼠发现肺部形成转移瘤，并经HE染色证实为肺腺瘤。

将肿瘤细胞与基质胶制成混悬液注入肺内可有效避免悬液外溢导致的弥漫性生长，有利于原位模型的建立^[20]。

2.2   血液转移

陈愉生等^[22]将1×10⁶个对数生长期的A549细胞注射入裸鼠尾静脉，第5周开始观察到肺部转移，于第11周小鼠出现恶液质，操作过程中小鼠存活率100%。成功经血液转移途径构建肺癌原位转移模型。

2.3   淋巴转移

淋巴转移是肺癌恶性的标志，也是其他恶性肿瘤晚期的特征。Takizawa等^[23]将可形成纵隔淋巴转移的人肺癌细胞Ma44-3细胞与Matrigel混合均匀，最终以2.0×10⁴个/只的浓度注射入SCID小鼠左肺。术后12天观察到纵隔淋巴结转移。淋巴转移的范围是评估早期非小细胞肺癌患者能否进行手术治疗的重要指标^[24]。

2.4   骨转移

骨转移是肺癌患者最常出现的转移部位，转移率为30%~40%^[16]。骨转移可引起疼痛、病理性骨折等，降低患者的生活质量。血流播散法，局部注射法及原位移植法是目前常用的肿瘤骨转移动物建模方法^[25-27]。

血流播散法主要是通过心脏注射或尾静脉注射的方式，将肿瘤细胞注射至动物体内。Goodale等^[25]实验观察到经尾静脉注射途径，血液循环中肿瘤细胞可迅速增高，在注射后1周循环中肿瘤细胞数降到最低，随后在第7周循环中肿瘤细胞数达到峰值。骨髓和淋巴结中的癌细胞数目显示出随着血液循环中癌细胞数目增加而增加。经心内注射癌细胞，在第4周，循环中癌细胞数达到峰值，第5周骨髓中的癌细胞数目达到峰值。血流播散法能较好地模拟肿瘤血液播散的转移途径，缺点是操作困难，实验动物容易在操作中死亡，并容易造成多处转移，转移部位不容易控制，且取决于注射的肿瘤细胞数量。总的来说，心内注射比起尾静脉注射可显著增高骨髓中肿瘤细胞的数目。

崔永奇等^[26]将4种肺腺癌细胞系A549、H1299、SPC-A-1、XL-2的细胞悬液按1×10⁶个/只通过左心室注射至裸鼠，发生骨转移的平均时间分别为（33±1）、（57±4）、（32±3）、（15±2）天，骨转移的概率分别为60%、40%、50%和40%。其中发生中轴骨转移的百分比分别为67%、75%、80%和75%，明显高于四肢骨转移。这与临床上肺癌骨转移的顺序一致，依次为中轴骨、股骨和肱骨等四肢长骨^[26]。

孟越等^[27]通过短暂免疫抑制的方法在免疫功能正常小鼠体内模拟肿瘤患者体内的环境。在6周龄雌性C57BL/6J小鼠腹腔内分别注射环磷酰胺（CTX）100、150、200 mg/kg，连续注射3天，第5天再将浓度为1.0×10⁹个/升的A549细胞悬液接种于小鼠右后肢胫骨平台下。肺癌细胞接种后7天，肉眼可观察到中/高等剂量免疫抑制组小鼠的右后肢肿胀，并且逐渐增大，2周时开始影响右后肢正常功能。肿瘤细胞接种4周后处死小鼠，观察到低剂量组成瘤率为11.11%（1/9），中剂量组为87.5%（7/8），高剂量组为100%（4/4）。其中低剂量组实验过程中无死亡，中等剂量组实验过程中死亡1只，高剂量组实验过程中死亡5只。中等剂量组建模成功率远高于低剂量组同时死亡率低于高剂量组，说明中等剂量免疫抑制剂更适合于制备小鼠肺癌骨转移模型。

原位移植法建立骨转移模型的特点是，实验技术比较成熟，但是骨转移率低。而局部注射法建模成功率高，但对其属于原发肿瘤还是转移肿瘤仍有争议。这种方法模拟了肿瘤细胞定位于骨组织后的过程，却无法模拟出肿瘤转移的过程，然而这种方法耗时短、费用低，并且适合长时间观察，进行药物实验^[24]。

2.5   脑转移

脑转移发生率为25%~40%^[17]，是肺癌最常见的远处转移之一。脑内局部原位注射、尾静脉注射、颈内动脉注射和左心室注射是构建脑转移癌动物模型的4种常用方法。

吴涛等^[28]将3×10⁵个LTEP/P人SCLC细胞通过立体定位仪接种于14只裸鼠颅内，术后第七天有一只裸鼠死亡，其余小鼠均出现不同程度的病态表现。此时将小鼠处死，脑组织经病理检查证实均已成瘤。脑内局部原位种植，建模成功率高，但无法模拟出肿瘤细胞的生长到发生转移过程中细胞转化、增殖、毛细血管新生、细胞入侵、进入血管形成癌栓，然后经过血液循环形成脑转移瘤等多个步骤，因此在模拟肿瘤发生机制上存在局限性。

通过尾静脉注射构建脑转移成功率较低，此方法建立肺、骨等其他部位转移的概率较高。而PC-14是可产生脑转移的人肺腺癌细胞株，首次接种后约25%的裸小鼠发生脑转移。张峻青等^[29]通过反复尾静脉裸鼠体内接种的方法，将1×10⁶个PC-14肺癌细胞接种于裸鼠经4个循环筛选得到特异的脑转移亚株PC-14/B。再经尾静脉注射将1×10⁶个PC-14/B细胞接种于裸鼠可产生4/5的肺癌脑转移。

徐磊等^[30]通过颈内动脉将1×10⁵个稳定转染绿色荧光蛋白（GFP）的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6X小鼠，注射3周后在荧光显微镜下观察到脑组织标本有绿色荧光蛋白的富集区域，证实脑部有Lewis肺癌细胞增殖、形成肿瘤，成功建立肺癌脑转移动物模型。本例手术的成功存活率为93.75%，手术成功的小鼠术后100%发生脑转移癌，未使用药物处理的自然病程中小鼠的中位生存时间为24.5天。

徐磊等^[30]实验过程观察到部分脑转移阴性的裸鼠脑组织血管旁有散在的肿瘤上皮细胞，但无肿瘤转移灶形成，分析其可能的原因是实验小鼠过早死亡，而死亡的原因是肺转移导致的恶液质。由于在尾静脉接种肿瘤细胞后，肿瘤细胞首先被肺毛细血管床捕获形成转移灶，而部分细胞随着血流流向脑血管，透过血脑屏障形成转移灶，故有学者推测使用左心室内注射可减少肺转移灶的形成，从而提高脑转移形成的成功率^[31]。陈愉生等^[32]经左心室内注射途径成功构建脑转移模型，所有裸鼠均出现多发脑转移灶，而无肺转移灶。

2.6   肝转移

在M1b肺癌患者中，小细胞肺癌患者发生的转移中有61.9%为肝转移^[33]。

杨顺芳等^[34]将1×10⁶和1.5×10⁶个肺癌CPA-Yang2细胞分别通过左心室和尾静脉注射至裸鼠体内，术后3~4周解剖小鼠，肉眼可见肝脏转移，转移率为60%。

3   其他模型-肺癌组织PDX模型

相比于肿瘤细胞系悬液建模的方法，人源性移植瘤模型（patient-derived xenograft, PDX）最大程度上保留肿瘤的微环境，可更加深入研究肿瘤－间质的相互作用，且PDX经数次传代后仍可保留与亲代相似的组织病理学，免疫组织化学表型，同时基因检测均与来源肺癌组织相一致^[35]，这一优点有利于抗肿瘤药物的试验，为个体化抗肿瘤治疗开辟新途径。然而PDX仍存在一定缺陷，其建模时间长，对外科操作要求高，原代移植成功率低。大多数PDX模型为皮下移植模型，这种模型能在一定程度上复制人类肿瘤的特点，但是极少发生转移^[36]，而人源性原位移植模型（patient-derived orthotopicxenografts, PDOX）可更好地模拟出患者体内的转移过程。Hiroshima等^[36]将宫颈癌组织原位移植至雌性裸鼠子宫，观察到其与人类相似的转移过程，在裸鼠中出现广泛腹膜转移、肝转移、肺转移以及淋巴转移，并且实验观察到PDOX模型较PDX模型更能真实反映患者对抗肿瘤药物治疗后的疗效，皮下移植和HER2阳性的PDX模型对恩替司他不敏感，而恩替司他对HER2阳性的PDOX模型转移瘤有显著抑制作用。

4   转移模型的应用

转移模型对肿瘤学的研究有重要作用，有助于深入了解肿瘤的发病机制。动物模型可在一定程度上模拟肿瘤患者的体内环境，因此可用于观察抗肿瘤药的疗效，推动新药研发。

韩淑燕等^[37]将消癌平注射液联合吉非替尼通过灌胃给药方式处理皮下接种方式构建的人非小细胞肺癌的H460和H1975裸鼠移植模型，通过比较瘤体体积、肿瘤增殖率和体重变化评估药物对移植瘤的抑制作用，并进一步研究其中的分子机制，发现药物抑制作用与PI3K等信号分子相关。

郑晓涛等^[38]利用A549细胞构建肺癌原位模型，并通过螺旋CT检查动态跟踪胸内肿瘤的生长情况，模拟临床上对肺癌患者的CT检查过程。CT检查结果则可评估抗肿瘤药的疗效。

5   总结和展望

建立肺癌实验动物模型是进行肺癌相关研究中最基础的一步，其对于肺癌的发生、发展、转移、治疗等方面的研究有着极其重要的意义。本文我们探讨了不同免疫缺陷小鼠的特点及优缺点，系统详细的介绍了多种小鼠转移模型的建立方法及其优缺点。进行肺癌研究时，应根据研究目的，模型特点以及实验动物的特点来选择合适的建模方式。目前虽有多种建模方式，但均无法完全模拟出人类肿瘤的发生发展过程，而肺癌的发病率和死亡率长期居高不下，因而有必要寻找新的建模方式，以更好地模拟出肺癌在体内的生理病理过程，这样才能在肿瘤的防治上取得更大的突破。