0   引言

胃癌是目前世界范围内发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤，一经发现多为晚期，传统的放化疗治疗效果不佳，预后极差。生物免疫治疗是本世纪快速发展的新治疗方法，目前对于胃癌的生物免疫治疗也是研究热点，CAR-T免疫效应细胞治疗和以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点阻断治疗被认为是最具潜力的治疗策略^[1-3]。在我们前期的研究中^[4-5]，采用免疫效应细胞CIK细胞分别联合EGFR/CD3双特异性抗体和EGFR单克隆抗体治疗胃癌种植瘤模型动物，取得了积极的结果。国内外研究报道^[6-7]溶瘤痘苗病毒对于肿瘤免疫微环境具有显著地重塑作用，而且其在抗肿瘤治疗中表现出了巨大的潜力。使用溶瘤病毒达到肿瘤免疫微环境重塑后必须给予强有力的抗肿瘤免疫效应细胞趋化至肿瘤部位，同时给予免疫检查点阻断治疗最大程度提升这些免疫效应细胞的抗瘤活性才能达到现有条件下最优化免疫治疗。因此，本研究采取了携带T淋巴细胞趋化因子CXCL9基因和强力免疫调节抑瘤因子IL-7基因的重组溶瘤痘苗病毒作为感染重塑肿瘤免疫微环境的先导，而后联合杀伤性淋巴细胞（CTL）和免疫检查点治疗的三联治疗干预胃癌模型动物以探讨该治疗策略的有效性，为进一步应用于临床打下基础。

1   材料与方法

1.1   材料

CXCL9单克隆抗体、IL-7单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CXCL9 ELISA检测试剂盒和IL-7 ELISA检测试剂盒（英国Abcam公司）；人外周血淋巴细胞分离液（北京Solarbio公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），其他试剂为国产分析纯。85-2恒温加热磁力搅拌器（上海志威电器有限公司）；微孔滤膜（欣惠泽奥有限公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒径分析仪（英国马尔文公司）；人胃腺癌细胞株SGC7901（北京富众科技发展有限公司），细胞培养于含胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM培养液中。人CD8+T淋巴细胞磁珠分选试剂盒购自美国eBioscience公司；替雷利珠单抗（PD-1单抗）注射液购自百济神州（苏州）生物科技有限公司；重组溶瘤痘苗病毒（VV-IL7-CXCL9）以vaccinia virus（WR, NIH TC-adapted）株（BioVector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心）为基础构建，由中国人民解放军总医院第八医学中心消化科保存，细胞实验于中国人民解放军总医院第八医学中心实验室进行。实验动物BALB/c裸鼠65只，雌性，6~8周龄，体质量18~22 g。动物实验于中国人民解放军总医院第八医学中心动物实验室进行，实验条件：温度22 ℃~25 ℃，相对湿度40%~70% RH，相对空气压力10~20 Pa，空气交换频率10~15次/小时，备有中央空调和空气过滤机械设备，动物笼具、垫料、饮用水等均经高压蒸汽消毒，每笼3只鼠，饲以SPF级专用颗粒饲料，自由饮水。基本试剂及仪器由实验室提供。

1.2   研究方法

1.2.1   裸鼠人胃癌种植瘤模型制备

参照李春梅等^[8]方法，取对数生长期的人胃癌细胞系SGC-7901细胞，PBS洗涤3次，重悬于PBS中并调整浓度为6×10⁷/ml。于每只裸鼠右侧腋部皮下注射0.2 ml细胞悬液，观察成瘤情况。7~l0 d成瘤（瘤体直径>0.5 cm为制备成功的标准），分组治疗前统一建模，建模不成功者直接剔除。制备成功60只裸鼠（实验分组共需56只，另4只用于抵补到出现观察期中死亡及其他原因退出实验的裸鼠），而后按下述分组情况开始分组治疗。

1.2.2   CTL细胞的制备

参照肖琅等^[9]的方法，取健康献血者外周血200 ml，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细胞悬于含10%血清的RPMI1640培养液中，在上述培养液中加入IL-2至200 u/ml，培养7 d，然后孵育CD8抗体，通过磁珠分选试剂盒筛选CD8+CTL细胞，相关操作流程严格按照试剂盒说明书进行。筛选得的CTL细胞经流式细胞仪检测CD8+细胞比率加以验证，具体操作按照流式细胞检测说明进行。

1.2.3   体内抑瘤实验

荷瘤裸鼠按数字表法随机分为8组（0.9%氯化钠溶液经尾静脉注射为对照组已计入八组内），每组7只。A组：VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹vp/肿瘤，多个部位瘤内注射+CTL细胞（1×10⁹/ml，1 ml）尾静脉注射+替雷利珠（100 μg药物用0.9%氯化钠溶液稀释）尾静脉注射；B组：VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹vp/肿瘤，多个部位瘤内注射+CTL细胞（1×10⁹/ml，1 ml）尾静脉注射；C组：VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹vp/肿瘤，多个部位瘤内注射+替雷利珠（100 μg药物用0.9%氯化钠溶液稀释）尾静脉注射；D组：等量0.9%氯化钠溶液瘤内注射+CTL细胞（1×10⁹/ml，1 ml）尾静脉注射+替雷利珠（100 μg药物用0.9%氯化钠溶液稀释）尾静脉注射；E组：VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹vp/肿瘤，多个部位瘤内注射；F组：等量0.9%氯化钠溶液瘤内注射+CTL细胞（1×10⁹/ml，1 ml）尾静脉注射；G组：等量0.9%氯化钠溶液瘤内注射+替雷利珠（100 μg药物用0.9%氯化钠溶液稀释）尾静脉注射；H组：等体积量0.9%氯化钠溶液瘤内及经尾静脉注射作为对照组。每5 d重复治疗1次，即分别于第1、5、10、15、20、25日给药，共给药6次。每3 d测量1次肿瘤长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V），V=a×b²/2。实验开始后第15 d及第30 d上IVIS Lumina LT小动物活体成像系统（美国PerkinElmer）行活体生物发光检测成像并记录，生物发光实验方法参考王剑超等的方法^[10]。第30 d处死裸鼠，剥离瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率=[（对照组瘤重－实验组瘤重）/对照组瘤重]×100%。

1.2.4   模型动物干预后血清及肿瘤组织匀浆IL-7及CXCL9水平变化

第30 d处死裸鼠采用眼球取血法每只鼠取血1.5 ml，室温静置４h，3 000 r/min离心10 min后移液器吸取上清液，−80℃保存以备检测。各组荷瘤裸鼠处死后剥除肿瘤组织称重后切取0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm的组织块（各组织块修整后称重为40 mg），0.9%氯化钠溶液冲洗3次后以50 mg/ml比例加0.9%氯化钠溶液，4℃环境下充分研磨，组织研磨均匀后移入EP管中，在4℃（3 000 r/min）离心20 min，收集上清液−80℃保存以备检测。检测采取ELISA法，操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.5   模型动物干预后肿瘤组织CD8+细胞的检测

通过免疫组织化学法检测治疗后异种移植小鼠肿瘤组织中CD8阳性细胞的水平，以确定CTL效应细胞趋化迁移到肿瘤组织中的情况。剥除肿瘤切取部分标本用于匀浆检测后用石蜡包埋。从石蜡包埋的组织块上切下5 μm厚的组织切片，然后进行CD8免疫组织化学染色分析。采用免疫组织化学阳性细胞计数法分析，在40倍光学显微镜下随机选择10个不重叠视野，计数阳性着色细胞数，每只小鼠选3张切片，每组7只小鼠全部计数，而后求出每张切片平均阳性细胞数进行组间比较。

1.3   统计学方法

利用双因素及单因素方差分析等方法进行统计学分析。所有数据均采用SPSS 17.0统计软件包进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   CTL细胞中CD8+细胞比例检测

流式细胞仪法检测制备的CTL细胞中CD8+细胞比例，结果提示CD8+细胞比例为87.3%，细胞均一性较好符合免疫治疗效应细胞要求。

2.2   体内抑瘤实验结果

以裸鼠移植瘤体积均值绘制肿瘤生长曲线，各组肿瘤体积随时间变化，见图1。按照肿瘤质量法计算，治疗后30 d各治疗组抑瘤率比较：A组抑瘤率显著高于其他各组（P<0.05）；B、D两组除显著低于A组外均显著高于其他各组，且B组显著高于D组（P<0.05）；C、E、F三组显著高于G、H两组（P<0.05），但该三组之间两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）；G、H两组之间差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

图  1  实验动物肿瘤生长曲线

Figure  1  Tumor-growth curve of experimental animals

A: VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹ vp/intratumoral injection+CTL cells at multiple tumor sites (1×10⁹/ml, 1 ml) tail-vein injection+Tislelizumab (100 μg normal saline dilution) tail-vein injection; B: VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹ vp/intratumoral injection+CTL cells at multiple tumor sites (1×10⁹/ml, 1 ml) tail-vein injection; C: VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹ vp/intratumoral injection of multiple tumor sites+Tislelizumab (100 μgnormal saline dilution) tail-vein injection; D: injected+CTL cells (1×10⁹/ml, 1 ml) tail-vein injection+tirelizul (100 μg normal saline dilution) tail-vein injection; E: VV-IL7-CXCL9 1×10¹¹ vp/intratumoral injection at multiple tumor sites; F: CTL cells (1×10⁹/ml, 1 ml) tail-vein injection; G: intratumoral injection of equal amount of normal saline+Tislelizumab (100 μg normal saline dilution) tail-vein injection; H: the same volume of normal saline was injected into the tumor and through the tail vein as the control group.

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表  1  各组裸鼠治疗后肿瘤质量及抑瘤率（$\bar x \pm s $, mg）

Table  1  Tumor mass and tumor inhibition rate of nude mice in each group after treatment ($\bar x \pm s $, mg)

Group	n	Tumor mass (mg)	Inhibition rate (%)
A	7	316.46±27.25	78.06±4.38#
B	7	518.76±34.15	64.03±5.55¥
C	7	833.43±43.27*	42.21±3.09*
D	7	669.42±37.06	53.58±4.07&
E	7	852.57±39.88	40.88±3.64*
F	7	884.13±45.21	38.69±4.64*
G	7	1407.55±66.65	2.39±0.27
H	7	1442.08±73.58	0
Notes: #: P<0.05, compared with other groups in pairs; ¥: P<0.05, compared with other groups except for Group A; &: P<0.05, compared with other groups except for Groups A and B; $* $: P<0.05, compared with Groups G and H.

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2.3   体内抑瘤实验活体生物发光检测结果

0.9%氯化钠溶液空白对照组和各治疗组荷瘤裸鼠肿瘤范围和光子量随时间进行性升高，但升高的程度明显不同。A、B、C、D、E、F、G、H组在第15日与第30日的平均光子量分别为4.43、10.37、25.85、17.67、26.09、27.24、36.5、35.95和6.53、17.44、34.56、25.84、35.07、35.96、45.82、46.76，与空白对照组相比，除H组外其他各干预组荷瘤裸鼠肿瘤范围和光子量均受到不同程度的抑制。与空白组比较，处理前各组肿瘤光子量差异无统计学意义（P>0.05）。给药第15 d和30 d行生物发光检测时，A组抑瘤率显著高于其他各组（P<0.05）；B、D两组除显著低于A组外均显著高于其他各组，且B组显著高于D组（P<0.05）；C、E、F三组显著高于G、H两组（P<0.05），但该三组之间两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）；G、H两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。A组两时间点肿瘤光子量抑制率分别为74.65%和85.31%，该结果与肿瘤质量法计算的抑瘤率比较结果基本一致，见图2。

图  2  第15日生物活体发光检测成像及荷瘤裸鼠肿瘤光子量

Figure  2  Bioluminescence detection imaging and tumor photon quantity of nude mice bearing tumors on the 15^th day

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2.4   各组动物干预后血清及肿瘤组织匀浆IL-7及CXCL9水平变化

各组动物干预后血清中IL-7和CXCL9浓度差异均明显，其中A、B、C、E组显著高于其他各组。各组肿瘤组织匀浆中IL-7和CXCL9浓度差异均明显，结果与血清中浓度差异一致，见表2。

表  2  各组实验动物血清及肿瘤组织匀浆细胞因子水平比较（$\bar x \pm s $, Pg/ml）

Table  2  Comparison of cytokine levels in the serum and tumor tissue homogenate of experimental animals in each group ($\bar x \pm s $, Pg/ml)

Groups	Serum IL-7	Serum CXCL9	Homogenate IL-7	Homogenate CXCL9
A	79.48±5.74*	146.11±11.59*	449.22±26.38*	320.24±36.17*
B	74.66±7.23*	151.24±15.32*	415.36±34.72*	348.06±46.22*
C	76.68±8.92*	154.16±17.77*	434.29±39.17*	314.88±41.51*
D	14.29±2.17	7.42±1.28	53.44±6.37	16.25±2.58
E	71.23±9.43*	144.69±13.28*	422.34±27.11*	329.46±32.19*
F	10.66±1.58	4.57±0.76	44.24±4.21	12.46±2.11
G	12.06±1.86	4.19±0.53	38.64±5.22	14.19±3.15
H	10.12±1.39	3.58±0.33	35.96±5.27	12.38±2.68
Note: $* $: P<0.05, pairwise compared with groups D, G, F and H, respectively.

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2.5   各组动物干预后肿瘤组织CD8+ CTL细胞的免疫组织化学检测结果

各组动物肿瘤组织中CD8+细胞可见细胞膜及部分胞质出现均匀一致棕黄色颗粒，见图3。CD8+细胞各组平均计数与空白对照H组比较，A组和B组显著高于其他各组（P<0.05），而D组和F组又显著高于除A、B两组之外的其他各组（P<0.05），C组和E组仅有少量细胞为阳性但显著高于G、H组（P<0.05），G、H组为阴性表达，见表3。

表  3  免疫组织化学检测各组肿瘤组织CD8+细胞（$\bar x \pm s $）

Table  3  Immunohistochemical detection of CD8+ cells in the tumor tissue of each group ($\bar x \pm s $)

Group	CD8+ cell count
A	139.4±17.5#
B	126.9±21.2#
C	6.4±1.2*
D	35.3±7.7¥
E	5.3±1.0*
F	31.6±6.4¥
G	0
H	0
Notes: #: P<0.05, compared with other groups except for groups A and B; ¥: P<0.05, compared with groups C, E, G and H, respectively; $* $: P<0.05, compared with groups G or H, respectively.

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图  3  各组肿瘤组织CD8+细胞的免疫组织化学染色

Figure  3  Immunohistochemical staining of CD8+ cells in tumor tissues of each group

A-H: group A to H.

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3   讨论

胃癌目前在世界范围内发病率居所有恶性肿瘤第七位，在我国居第三位，恶性程度高，疾病负担沉重，是人类医学的重大难题^[11]。针对晚期胃癌有效而低不良反应的治疗方法是目前研究的热点。生物免疫治疗作为最接近人体自然抵抗肿瘤方式的治疗方法近年来成为主要的方向，许多生物免疫治疗方案在结肠癌、恶性淋巴瘤等多种恶性肿瘤中都取得了令人鼓舞的成果，但国内外针对胃癌的生物免疫治疗研究与临床实践相对滞后^[12-13]。本研究组前期研究提示抗体联合CIK细胞均能发挥良好的抗肿瘤作用。但实验结果也提示了几个主要的问题：（1）抗体联合CIK免疫效应细胞对肿瘤局部的杀伤作用仍不足。（2）抗体联合对免疫效应细胞的再导向作用偏弱。

本研究中采用的重组溶瘤病毒本身具有较强的溶瘤能力，而且感染肿瘤细胞后可产生重要的细胞因子IL-7和CXCL9，目前的研究认为IL-7在肿瘤中具有很强的炎性反应促进能力、协同免疫检查点阻断治疗能力及免疫微环境重塑能力^[14-15]。而CXCL9具有强大的T淋巴细胞趋化能力和一定的抑瘤能力，能从循环中募集具有抗瘤能力的T淋巴细胞向肿瘤组织聚集^[16-17]。因此我们的抗肿瘤策略为：首先通过局部的浸润注射由溶瘤病毒感染胃癌肿瘤组织形成炎性反应及溶瘤坏死过程引起免疫原释放，同时表达IL-7进一步激活炎性反应及维持CTL细胞免疫活性并协同免疫检查点阻断，表达CXCL9募集静脉注射的CTL免疫效应细胞大量浸润肿瘤组织，同时给予PD-1单抗阻断免疫检查点解除CTL细胞的免疫限制，进而综合上述过程形成强大的肿瘤免疫清除作用。

研究结果显示联合VV-IL7-CXCL9溶瘤病毒瘤内注射、CTL细胞尾静脉注射和替雷利珠尾静脉注射对于裸鼠胃癌移植瘤的抑制作用明显优于两两联合治疗及单一措施的治疗，这一结果与我们前期体外细胞培养结果相一致，提示溶瘤病毒、免疫效应细胞和免疫检查点阻断三联治疗抑瘤效果显著。实验结果也提示单独给予免疫检查点阻断剂治疗基本无效，这种情况可能是因为实验用裸鼠本身为免疫缺陷动物，其体内缺乏自身的T淋巴细胞，免疫检查点阻断剂缺少作用靶点无法起到治疗作用。本研究采用了肿瘤生长曲线法、肿瘤质量计数及活体生物发光法对抑瘤效果进行评估，各方法总体结果基本一致也反映了结果的可靠性。本研究采用了溶瘤病毒直接瘤内注射给药的方式可以显著提高肿瘤组织局部的病毒浓度进而提升感染率。在临床实践中对于胃癌这种发生于消化道的肿瘤可以通过内镜下直接瘤内注射实现类似的作用，相比中枢神经及体腔深处的肿瘤更容易实现局部给药治疗，因此该治疗策略对于治疗胃癌等消化系统肿瘤可能更加具有优势。

当然，本研究仍存在诸多不足，首先以模型动物为基础的实验为临床前研究，结果具有局限性，生物免疫治疗在人类机体的情况更为复杂、人体的组织结构情况、血管淋巴管转运情况、内皮网状系统以及更为重要的人体全身免疫系统作用都与免疫缺陷的裸鼠有很大不同。因此对溶瘤病毒、免疫效应细胞及免疫检查点阻断剂的优化和在更为高等动物模型体内实验研究将是我们下一步研究的工作重点。通过进一步完善的实验研究，将为溶瘤病毒、免疫效应细胞及免疫检查点阻断三联治疗胃癌进入临床打下坚实的基础。