Review on CD4+T Cells in Malignant Pleural Effusion
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摘要: 细胞免疫是人体免疫系统的重要组成部分，主要由CD8＋细胞毒T细胞及CD4＋辅助性T细胞介导机体免疫反应，其中CD4＋T细胞又包括多个亚群，如Th1、Th2细胞，目前又发现了新的亚群如Treg、Th17、Th9，均不同程度参与了疾病的免疫过程，而对于肿瘤的抑制或促进作用机制尚不清楚。本综述收集了恶性胸腔积液中有关CD4＋T亚群变化及可能机制的最新资料，分析其在肿瘤中的特性和作用以了解在肿瘤局部微环境的效应机制，为肿瘤的诊断治疗提供新的靶点。Abstract: Cellular immunity is an important part of human immune system, mainly mediated by CD8+cytotoxic T cells and CD4+ helper T cells. CD4+T cells include many subsets, for example, Th1 and Th2 cells, and the newly discovered subsets include Treg, Th17 and Th9 cells which are all involved in the tumor immune reaction at different degrees. But the mechanisms of inhibiting or promoting tumors remain unclear. This review collected the latest information of CD4+T subsets in malignant pleural effusion, including their changes, the possible mechanism, their roles in the tumor immune reaction, and provided a new targets for diagnosis and treatment of tumor.
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Key words:
- Regulatory T cell /
- T helper 17 /
- T helper 9 /
- Pleural effusion
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0 引言
弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是一种异质性血液恶性肿瘤，是发病率最高的一种非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）亚型，其发病率占成人非霍奇金淋巴瘤的30%~40% [1]。虽然临床上多种化疗方案，如利妥昔单抗、长春新碱、多柔比星、环磷酰胺和泼尼松等，大大提高了DLBCL患者的生存率，但仍有一部分DLBCL患者无法治愈，且容易复发[1-2]。因此仍然需要进一步开发药物改善DLBCL预后，提高疗效。RG-7388，又称Idasanutlin，是由罗氏公司开发的全球首个口服的二代临床双微体2（murine double minute 2, MDM2）蛋白抑制剂[3]。在骨肉瘤[4]、急性髓系白血病[5]、神经母细胞瘤[6]等多种肿瘤中有抗肿瘤活性，但在DLBCL中的作用尚未见报道。为此，本研究探讨MDM2抑制剂RG-7388对DLBCL的抑制效应及其机制，为RG-7388在DLBCL中的临床运用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
药物RG7388购自美国CSNpharm公司。IMDM培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。CCK8试剂盒购自于中国VICMED公司。PI/RNase Staining Buff er试剂购自美国BD公司。ClickiTplusEdU试剂盒购自美国ThermoFisher公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自中国索莱宝（Solarbio）公司。Caspase-Glo® 3/7酶活检测试剂盒购自Promega（北京）生物公司。抗体MDM2、p53、p27、p21、cdc25C、CDK6、cdc2、CyclinB1、PARP、Mcl-1、Bcl-xL、Vinculin购自美国CST公司，GAPDH购自中国武汉三鹰（Protein-tech）公司。流式细胞仪FACSCalibur购自美国Bio-Rad公司。Synergy Multi-Mode Reader购自美国BioTek公司。
1.2 细胞培养
DLBCL细胞株SUDHL2和HBL1购自美国菌种保藏中心，由本实验室保存于含10%FBS的IMDM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3 细胞增殖检测
CCK8法检测细胞增殖：将SUDHL2和HBL1细胞（15 000个/孔）接种到96孔板中，待细胞丰度长至80%，弃去上清液，每组细胞分别用含0.5、1、2、5、10、20 μmol/L RG7388的10%FBS的IMDM培养液处理72 h，每孔加入10 μl CCK8，37℃、5% CO2培养箱中避光孵育3 h。酶标仪测定450 nm处吸光值。
EdU法检测细胞增殖：将SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后，加入0.1%的EdU，于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。洗涤和收集细胞沉淀后用100 μl 1×iClick固定剂室温避光固定15 min。随后用100 μl 1×iClick渗透和洗涤试剂处理静置20 min。200 μl 1×iClick反应液孵育30 min，洗涤液洗涤2次后PBS重悬沉淀后检测。
1.4 细胞周期检测
将SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞12h后，收集细胞并固定在70%预冷乙醇中，4℃过夜。PBS洗涤细胞后，200 μl PI/RNase染色缓冲液避光染色30 min，PBS洗涤3次后，200 μl PBS重悬。流式细胞仪检测细胞周期变化，FlowJo10软件分析结果。
1.5 细胞凋亡检测
Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡。SUDHL2和HBL1细胞接种于6孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后收集细胞，200 μl 1× Binding buffer重悬细胞，每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI避光孵育20 min，使用流式细胞仪进行检测。FlowJo10软件分析结果。
Caspase-Glo® 3/7酶活法检测细胞凋亡：将SUDHL2和HBL1细胞接种于96孔板中，用0、2、4、8 μmol/L RG7388处理细胞48 h后，每孔细胞加入100 μl Caspase 3/7工作液，室温避光孵育1 h后，多功能酶标仪检测荧光强度。
1.6 蛋白表达检测
用不同浓度的RG7388（2、4、8 μmol/L）处理细胞72 h后，细胞裂解液冰上裂解细胞，离心收集上清液。10%SDS-PAGE进行凝胶电泳，将蛋白电转于100 mA恒流转移到0.45 μmol/L PVDF膜上。封闭液室温封闭2 h，4℃摇床孵育各类一抗过夜。TBST洗三次，每次10 min。二抗室温孵育1 h。TBST洗三次，每次10 min。用ECL化学发光试剂和化学发光成像仪（型号：ImageQuant LAS 4000 mini）检测。
1.7 统计学方法
运用SPSS27.0软件和GraphPad Prism 6软件统计分析和绘图。计量资料采用均数±标准差（x ±s）表示，两组以上均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RG7388抑制SUDHL2和HBL1细胞增殖
CCK8法检测结果发现：在SUDHL2和HBL1细胞中，RG7388的IC50分别为3.36和3.76 µmol/L，其抑制作用呈剂量依赖性，见图 1。EdU法检测结果表明，RG7388处理的SUDHL2（图 2A）和HBL1（图 2B）EdU阳性细胞数显著低于对照组（P < 0.001），且呈剂量相关性。这些结果表明RG7388可有效抑制SUDHL2和HBL1细胞的增殖。
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图 1 CCK8法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞的增殖抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of RG7388 on the proliferation of SUDHL2 and HBL1 cells was detected by CCK8 assay![]()
图 2 EdU法检测不同浓度RG7388对SUDHL2(A)和HBL1(B)细胞的增殖抑制作用Figure 2 EdU assay was used to detect the inhibitory effects of different concentrations of RG7388 on SUDHL2(A) and HBL1(B) cellsCompased with 0 μmol/L RG7388 group; **: P < 0.01; ***: P < 0.001, ****: P < 0.0001.2.2 RG7388阻滞SUDHL2和HBL1细胞周期
RG7388处理的SUDHL2和HBL1细胞中，随RG7388浓度的增加，G1期细胞比例显著增高。2、4、8 µmol/L RG7388处理SUDHL2细胞中，G1期细胞比例显著高于对照组（均P < 0.05）。与对照组相比，2、4、8 µmol/L RG7388处理HBL1细胞G1期细胞比例显著升高（t=2.448, P=0.019; t=2.776, P=0.012; t=2.776, P=0.011）。在两种DLBCL细胞中，S期细胞比例明显随药物处理浓度增高而下降。G2期细胞比例基本不变或只产生微弱变化。表明RG7388可诱导DLBCL细胞周期阻滞在G1期，从而抑制细胞增殖，见表 1。
表 1 RG7388处理后SUDHL2和HBL1细胞周期变化Table 1 Cell cycle of SUDHL2 and HBL1 cells treated with RG7388
2.3 RG7388诱导SUDHL2和HBL1细胞凋亡
不同浓度RG7388处理48 h后，早期凋亡（Q2）和中晚期凋亡（Q3）细胞比例均显著增加。2、4、8 µmol/LRG7388处理的SUDHL2细胞中凋亡细胞比例分别为（37.9±5.46）%，（46.8 ±5.76）%和（59.0±5.32）%，显著高于对照组（8.59±2.63）%（F=56.34, P < 0.001）。HBL1细胞中，2、4、8 µmol/L RG7388处理组中凋亡细胞比例分别为（24.1±3.61）%，（33.9±4.29）% 和（50.0±4.57）%，也显著高于对照组（2.7± 0.93）%（F=89.21, P < 0.001），见图 3。与对照组比，随着RG7388浓度增高，Caspase3/7酶活性明显增高。其中在SUDHL2细胞中8 μmol/L RG7388处理组Caspase 3/7酶酶活性高达4倍，HBL1细胞中高达3倍，见图 4。表明RG7388促进了SUDHL2和HBL1细胞凋亡。
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图 3 流式细胞术检测不同浓度RG7388对SUDHL2和HBL1细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of different concentrations of RG7388 on apoptosis of SUDHL2 and HBL1 cells detected by flow cytometry![]()
图 4 Caspase 3/7-GloTM酶活法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of RG7388 on apoptosis of SUDHL2 and HBL1 cells detected by Caspase 3/7-GloTM enzyme activity method*: compared with 0 μmol/L group, *: P < 0.05.2.4 RG7388激活p53通路诱导SUDHL2和HBL1细胞周期阻滞和细胞凋亡
随药物浓度增高，p53蛋白表达水平增加；细胞周期负调控蛋白p27和p21表达水平增加；细胞凋亡相关蛋白PARP蛋白水平明显增高；细胞凋亡负调控蛋白Mcl-1、Bcl-xL表达水平则呈明显递减趋势，见图 5。由此可见，MDM2抑制剂RG7388能激活p53通路从而抑制细胞周期和诱导细胞凋亡。
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图 5 蛋白免疫印迹法检测RG7388对SUDHL2和HBL1细胞周期和凋亡相关蛋白表达的调控作用Figure 5 Western blot analysis of effect of RG7388 on the expression of SUDHL2 and HBL1 cell cycle and apoptosis-related proteinsCompared with 0 μmol/L RG7388 group, *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.3 讨论
DLBCL是一种最常见的异质淋巴瘤类型，约占所有淋巴样恶性肿瘤的20%[7]。尽管大多数DLBCL患者对一线化疗疗法R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松）或类似方案有应答，但仍有约40%的患者会出现复发或转移[8]。开发新的精准分子靶向药物治疗DLBCL具有重要意义。本研究结果表明MDM2抑制剂RG7388可在体外有效抑制DLBCL细胞增殖。由此可见，RG7388可能是一种潜在的DLBCL治疗药物。
RG7388是一种可口服的小分子MDM2蛋白抑制剂。MDM2是p53抑癌基因的负调控因子。临床前研究证实，RG7388作为单一药物可导致p53基因活化增加、细胞周期阻滞和凋亡[9]。p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，在正常情况下不表达或低表达。然而，在生理应激下，其半衰期延长，导致p53在细胞核中积累，在细胞核中高表达，发挥转录因子的作用。p53可以结合并激活多种靶基因的表达，发生不同的细胞反应，包括DNA修复、细胞周期阻滞、衰老或凋亡。在正常生理条件下，p53水平保持在较低水平，不断被MDM2降解。MDM2是一种E3泛素连接酶。MDM2n端与p53结合，泛素化c端结构域的几个赖氨酸残基则靶向p53，对p53进行蛋白酶体降解。随着MDM2与p53结合的结构细节的阐明，以及对这种相互作用的重要性的认识，阻止MDM2与p53结合成为一种积极的治疗策略[9-10]。抑制MDM2或恢复野生型p53蛋白的肿瘤抑制功能可有效抑制肿瘤形成。RG7388是p53-MDM2相互作用的第二代选择性抑制剂。与第一代抑制剂nutlins相比，其药理特性更佳，包括效力、生物利用度的提高以及对p53-MDM2结合位点的选择性。在临床前建模和模拟研究中，每日或间歇给药时RG7388均可有效激活p53通路，导致野生型p53细胞系周期阻滞或凋亡，最终实现肿瘤停滞[11]。本研究发现RG7388处理的DLBCL细胞中，随着RG7388浓度的增加，DLBCL细胞增殖明显受到抑制、细胞周期阻滞在G1期，细胞发生凋亡。RG7388对DLBCL细胞生长的抑制效应呈剂量依赖效应。这提示MDM2抑制剂RG7388也可能在DLBCL治疗中同样发挥重要作用。RG7388靶向抑制MDM2，负调控p53。本研究也发现RG7388处理的DLBCL细胞p53蛋白水平增加，可能就是由于MDM2被抑制，p53增加所致，与其机制作用相符。
本研究中RG7388处理后，p53蛋白稳定性增强，从而激活了p53下游相关通路。在细胞周期调控中，RG7388处理的DLBCL细胞中，细胞周期抑制蛋白p27、p21表达上调。与G2/M相关的周期蛋白有Cyclin B1、cdc2、cdc25C，这三个周期蛋白相互联系并促进真核细胞进入有丝分裂，在RG7388作用后随药物浓度明显递减，说明细胞未能进入细胞分裂。G1/G0期周期蛋白CDK6也递减，进而使细胞不能越过G1/S期发生细胞阻滞。在细胞凋亡调控中，RG7388处理后，细胞凋亡相关蛋白PARP水平明显增高；细胞凋亡负调控蛋白Mcl-1、Bcl-xL表达水平则呈明显递减趋势。这个结果与Vernooij等[6]在神经母细胞瘤中的结果一致。
本研究不足之处：仅通过体外细胞实验探讨了MDM2抑制剂RG-7388对DLBCL细胞生长的抑制效应，后续还需要动物体内实验进一步论证其抑制作用。在临床运用方面，目前RG7388已进入临床Ⅲ期研究，是临床试验研究进展最快的小分子p53激活剂。但是相对于p53突变细胞系，RG7388只有适度的选择性，且RG7388消除p53野生型癌细胞的能力有限，RG7388的使用可能还会产生p53突变的耐药细胞群体[12]。因此后续DLBCL治疗研究还可以联合其他靶向药物进一步精准治疗p53突变的耐药肿瘤。
总之，MDM2抑制剂RG7388抑制DLBCL细胞增殖，通过p53通路引起G1期细胞阻滞并诱导细胞凋亡。RG7388可能是一种潜在的DLBCL治疗药物。
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[1] Mishra KP, Yadav AP, Shweta, et al. Ship-borne journey inducesTh1 cytokines level in antarctic summer expeditioners[J]. Immunol Invest,2010,39(7):770-9. [2] Kim C, Jay DC, Williams MA. Stability and function of secondaryTh1 memory cells are dependent on the nature of the secondary stimulus[J]. J Immunol,2012,189(5):2348-55. [3] Nevala WK, Vachon CM, Leontovich AA, et al. Evidence of systemic Th2-driven chronic inflammation in patients with metastatic melanoma[J]. Clin Cancer Res,2009,15(6):1931-9. [4] Dunham RM, Thapa M, Velazquez VM, et al. Hepatic stellate cells preferentially induce Foxp3+ regulatory T cells by production of retinoic acid[J]. J Immunol,2013,190(5):2009-16. [5] Savage PA, Malchow S, Leventhal DS. Basic principles of tumorassociated regulatory T cell biology[J]. Trends Immunol,2013,34 (1) :33-40. [6] Geiger TL, Tauro S. Nature and nurture in Foxp3(+) regulatory T cell development, stability, and function[J]. Hum Immunol,2012, 73 (3):232-9. [7] Yang XP, Ghoreschi K, Steward-Tharp SM, et al. Opposing regulation of the locus encoding IL-17 through direct, reciprocal actions of STAT3 and STAT5[J]. Nat Immunol,2011,12(3):247-54. [8] Bettelli E, Korn T, Oukka M, et al. Induction and effector functions of T(H)17 cells[J]. Nature,2008,453(7198):1051-7. [9] Liu Z, Fan H, Jiang S. CD4(+)T-cell subsets in transplantation[J]. Immunol Rev,2013,252(1):183-91. [10] Schmitt E, Bopp T. Amazing IL-9: revealing a new function for an “old” cytokine[J]. J Clin Invest,2012,122(11):3857-9. [11] Lu Y, Hong S, Li H, et al. Th9 cells promote antitumor immune responses in vivo[J]. J Clin Invest,2012,122(11):4160-71. [12] Ghayumi MA, Mojtahedi Z, Fattahi MJ. Th1 and th2 cytokine profi les in malignant pleural effusion[J]. Iran J Immunol,2011,8 (4) :195-200. [13] Okamoto M, Hasegawa Y, Hara T, et al. T-helper type 1/T-helper type 2 balance in malignant pleural effusions compared to tuberculous pleural effusions[J]. Chest,2005,128(6):4030-5. [14] DeLong P, Carroll RG, Henry AC, et al. Regulatory T cells and cytokines in malignant pleural effusions secondary to mesothelioma and carcinoma[J]. Cancer Biol Ther,2005,4(3):342-6. [15] Yang WB, Ye ZJ, Xiang F, et al. Th17/Treg imbalance in malignant pleural effusion[J]. J Huazhong Univ Sci Technol[Med Sci] ,2013,33(1):27-32. [16] Qin XJ, Shi HZ, Liang QL, et al. CD4+CD25+ regulator T lymphocytes in tuberculous pleural effusion[J].Chin Med J(Engl), 20 08,121(7):581-6. [17] Ye ZJ, Zhou Q, Gu YY, et al. Generation and differentiation of IL-17-producing CD4+T cells in malignant pleural effusion[J]. J Immunol,2010,185(10):6348-54. [18] Ye ZJ, Zhou Q, Zhang JC, et al. CD39+ regulatory T cells suppress generation and differentiation of Th17 cells in human malignant pleural effusion via a LAP-dependent mechanism[J].Respir Res,2011,12:77. [19] Ye ZJ, Zhou Q, Yin W, et al. Differentiation and immune regulation of IL-9-producing CD4+ T cells in malignant pleural effusion[J].Am J Respir Crit Care Med,2012,186(11):1168-79. -
期刊类型引用(3)
1. 魏伟，赵慧娟，刘湘翠. USP7-MDM2-p53信号轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响. 现代肿瘤医学. 2024(02): 214-220 . 
百度学术
2. 韩晓丽，黄景涛，赵宝山，孙光蕊，朱翠敏，梁宗英. 肺腺癌组织转化生长因子β_1、鼠双微体2表达变化及其与患者临床病理特征的关系. 山东医药. 2024(11): 60-63 . 百度学术
3. 赵瑾，于凤丽，关涛，马莉，郑美婧，苏丽萍. 血清FOXO1、Beclin-1水平与利妥昔单抗治疗初诊弥漫大B细胞淋巴瘤反应性关系及预测价值. 中华转移性肿瘤杂志. 2024(06): 580-587 . 百度学术
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