Effect of Down-regulating KLF8 Expression by siRNA on EMT in Nasopharyngeal Carcinoma Cells
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摘要:目的
探讨下调KLF8的表达对鼻咽癌CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响及其机制。
方法通过脂质体转染法将KLF8 siRNA真核表达质粒稳定转染至鼻咽癌细胞株CNE1-LMP1。Western blot和RT-PCR法检测CNE1-LMP1细胞中KLF8、E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA表达水平的变化。Transwell侵袭实验观察siRNA后对CNE1-LMP1细胞侵袭能力的影响。
结果KLF8 siRNA转染的CNE1-LMP1细胞株与其阴性对照NC-si组比较KLF8蛋白和mRNA表达水平均下调，证实稳转细胞株建立成功。KLF8 siRNA可上调CNE1-LMP1细胞中E-cadherin的表达，而下调N-cadherin的表达。Transwell侵袭实验显示siRNA干扰CNE1-LMP1细胞侵袭能力下降。
结论KLF8在鼻咽癌CNE1-LMP1细胞中高表达；通过siRNA下调KLF8的表达能干扰上皮间质转化（EMT）相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达，阻断EMT过程，抑制CNE1-LMP1细胞侵袭转移。
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关键词:
- Kruppel样转录因子8 /
- CNE1-LMP1细胞 /
- RNA干扰 /
- 上皮间质转化 /
- 侵袭
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of down-regulating the expression of KLF8 by siRNA interference on the invasion of human nasopharyngeal carcinoma cells CNE1-LMP1 and related mechanism.
MethodsThe siRNA targeting KLF8 was designed and the eukaryotic expression plasmid was synthesized. The plasmid was transfected into CNE1-LMP1 cells. The expression of KLF8, E-cadherin and N-cadherin protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR. Transwell invasion assay was employed to observe the invasion ability of CNE1-LMP1 cells through KLF8 siRNA.
ResultsThe expression levels of KLF8 protein and mRNA were down-regulated in the KLF8-siRNA-transfected CNE1-LMP1 cell lines compared with negative control (NC-si) group, which verified that the stable transfected cell lines were successfully established. KLF8 siRNA could up-regulate the expression of E-cadherin and down-regulate the expression of N-cadherin in CNE1-LMP1 cells. Transwell invasion assay showed that siRNA decreased the invasion ability of CNE1-LMP1 cells.
ConclusionKLF8 is highly expressed in nasopharyngeal carcinoma cells CNE1-LMP1. KLF8 siRNA could affect the expression of E-cadherin and N-cadherin, and inhibit the invasion and metastasis of CNE1-LMP1 cells.
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Key words:
- KLF8 /
- CNE1-LMP1 cells /
- RNA interference /
- EMT /
- Invasion
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0 引言
随着放疗技术的进步，鼻咽癌五年生存率明显提高，但局部侵袭和远处转移仍然是患者死亡的主要原因[1]。上皮间质转化（EMT）是肿瘤发生侵袭转移的重要机制，与鼻咽癌侵袭和远处转移密切相关[2]。Kruppel样转录因子8（KLF8）在多种肿瘤如胃癌、原发性肝癌、乳腺癌、肾癌中高表达，参与细胞的癌性转化、侵袭转移和EMT[3]。目前有关KLF8在鼻咽癌细胞中的表达及其在鼻咽癌侵袭转移中的作用研究不多。本研究采用siRNA干扰技术下调KLF8的表达观察其对CNE1-LMP1细胞系中EMT相关蛋白质及侵袭能力的影响，为鼻咽癌的基因治疗靶点提供依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系和试剂
鼻咽癌细胞系CNE1、CNE1-LMP1均购自中南大学湘雅中心实验室细胞库。KLF8 siRNA及NC siRNA的真核表达质粒由上海吉凯公司构建并测序鉴定，脂质体LipofectamineTM 2000购于上海吉玛公司，RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和SYBR Green Mix购于日本Toyobo公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 细胞培养
细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.3 质粒转染CNE1-LMP1细胞
按Lipofectin转染试剂盒的使用说明书操作，CNE1-LMP1细胞转染48 h后开始用含0.5 μg/ml嘌呤霉素选择性培养液进行筛选，至2周以后抗性细胞克隆形成。
1.4 Western blot检测KLF8及E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达
按试剂盒说明书提取细胞总蛋白并定量，各点样孔加入等量蛋白样品进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，然后加入相应的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，最后进行DAB显色。显色带经扫描后行灰度值扫描分析。
1.5 RT-PCR检测KLF8及E-cadherin、N-cadherin mRNA表达水平
用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA后取相同量的mRNA反转录为cDNA。KLF8上游引物为：5’-TACGGCAGGACTCTAGACAG-3’，下游引物为：5’-TCACATCATTGGTGTGCACT-3’；E-cadherin上游引物为：5’-AATAGTGGTGACGTTGTACCCCGA-3’，下游引物为：5’-TGGGGTAAGACGTTTGGGCAGGTCGAAT-3’；N-cadherin上游引物为：5’-GGCCAGCAAAGTCTCCAACTC-3’，下游引物为：5’-CCCACAAAGAGCAGCAGTC-3’；GAPDH上游引物为: 5’-TCGATTCAGCGAAACCGCACA-3’，下游引物为: 5’-TCACCGTGTGCTAGTGAAACC-3’。反应条件:95℃变性1 min，95℃变性45 s、67℃退火45 s、72℃延伸45 s，40次循环，72℃再延伸10 min。反应完成后在软件系统中调整基线和阈值，读出各反应孔Ct值，进行基因表达水平差异的比较。
1.6 Transwell侵袭实验
用50 mg/L Matrigel（1:8）稀释包被Transwell小室膜底部。将Transwell小室放入24孔培养板中，在小室外加入400 ml（1:1）混合的条件培养液和完全培养液，在小室内加入100 μl（1×105个）无血清肿瘤细胞悬液，每组重复3个样本，置培养箱内常规培养24 h。取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的Matrigel胶和未侵袭细胞，中性甲醛固定，染色。在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞。每个样本于镜下（×400）计数5个不同视野的侵袭细胞数，取平均值，计算侵袭细胞数。
1.7 统计学方法
所有数据经SPSS17.0处理，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 CNE1、CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA表达水平
Western blot结果显示，CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白表达水平为CNE1细胞的（1.834±0.049）倍，RT-PCR结果显示，KLF8 mRNA表达水平为CNE1细胞的（3.255±0.892）倍。KLF8蛋白和mRNA在CEN1-LMP1细胞中表达水平显著高于CNE1细胞，两者比较差异有统计学意义（P<0.05），见图 1。
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图 1 CNE1、CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA的表达Figure 1 Expression protein and mRNA of KLF8 in CNE1, CNE1-LMP1 cellsA: the expression of KLF8 protein; B: the expression of KLF mRNA2.2 KLF8 siRNA转染CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA表达水平
为了鉴定KLF8 siRNA转染CNE1-LMP1细胞是否成功构建，我们通过Western blot和RT-PCR进行了验证，结果显示，与阴性对照NC-si组比较，KLF8 siRNA转染CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA表达水平显著下降，差异有统计学意义（P<0.01），提示转染成功，见图 2。
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图 2 KLF8 siRNA转染CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA的表达Figure 2 The protein and mRNA expression of KLF8 in KLF8 siRNA transfected CNE1-LMP1 cellsA: the protein expression of KLF8 in KLF8 siRNA transfected CNE1-LMP1 cells; B: the mRNA expression of KLF8 in KLF8 siRNA transfected CNE1-LMP1 cells2.3 KLF8 siRNA干扰CNE1-LMP1细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA表达水平
KLF8 siRNA干扰CNE1-LMP1细胞中E-cadherin蛋白表达为阴性对照NC-si组的（1.303±0.029）倍，mRNA表达为（1.842±0.095）倍；N-cadherin蛋白表达为阴性对照NC-si组的（0.211±0.017）倍，mRNA表达为（0.361±0.057）倍。可见CNE1-LMP1细胞中E-cadherin蛋白和mRNA表达在KLF8 siRNA干扰后显著升高（P<0.05），而N-cadherin蛋白和mRNA表达则显著下降（P<0.05），见图 3。
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图 3 KLF8 siRNA干扰CNE1-LMP1细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA表达Figure 3 The protein and mRNA expression of E-cadherin, N-cadherin in KLF8-siRNA-transfected CNE1-LMP1 cellsA: the protein expression of E-cadherin and N-cadherin; B: the mRNA expression of E-cadherin and N-cadherin2.4 细胞侵袭能力检测
Transwell侵袭实验显示，KLF8 siRNA干扰后，CNE1-LMP1细胞和阴性对照NC-si组穿膜细胞数分别为（61.55±9.73）和（148.3±27.89），KLF8 siRNA干扰后CNE1-LMP1细胞侵袭能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），见图 4。
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图 4 KLF8 siRNA干扰后CNE1-LMP1细胞侵袭能力减弱Figure 4 KLF8 siRNA decreased invasion ability of CNE1-LMP1 cells3 讨论
KLFs是一类具有锌指结构的基本转录因子，它能够结合DNA中的GC盒或相关的CACCC元件，通过调控富含GC启动子的基因表达，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及胚胎发育、癌症发生等生理病理过程[4]。研究发现，KLF8在多种人类恶性肿瘤中过表达，在致癌转化中起重要作用，具有很强的诱导EMT作用[5]。
EMT是具有极性的上皮细胞转化为具有活动能力的间质细胞的过程，被认为是肿瘤细胞由非侵袭转变为侵袭状态、继而发生转移的一个决定性步骤[6]。E-cadherin和N-cadherin是EMT中两个标志性蛋白[7]。E-cadherin表达降低或缺失是EMT最显著的特征，同时也是多种肿瘤不良预后及转移的临床预后指标[8]。N-cadherin可促使肿瘤细胞从肿瘤原位中脱离出来并与内皮或基质成分黏附，发生EMT，从而具有侵袭性表型并且易于远处转移[9]。我们前期的研究表明[10]，鼻咽癌EMT过程中E-cadherin表达下降，N-cadherin表达上升，细胞运动能力和侵袭能力增强。
LMP1是在鼻咽癌细胞中表达的唯一具有转化能力的EBV基因产物，被认为具有癌基因功能，有促进细胞转化甚至恶变的性质[11]。LMP1稳定转染的CNE1-LMP1细胞具有更强的增殖、分化、侵袭和转移能力[12]。本研究发现KLF8 mRNA及其蛋白在CNE1-LMP1细胞中表达水平较未转染的CNE1细胞显著升高（P<0.05），推测在CNE1-LMP1细胞株中KLF8的高表达可能与细胞的高侵袭性密切相关，是EMT的重要诱导因子。为验证KLF8在鼻咽癌EMT的意义，本研究通过RNA干扰技术构建KLF8 siRNA质粒转染CNE1-LMP1，运用RT-PCR和Western blot检测结果显示该干扰质粒可以明显下调KLF8的表达，经鉴定后显示稳转细胞株成功建立。
进一步结果显示，经KLF8 siRNA干扰后，CNE1-LMP1细胞中E-cadherin蛋白和mRNA表达显著升高，而N-cadherin蛋白和mRNA表达则显著下降，而E-cadherin、N-cadherin和EMT密切相关，说明KLF8可能参与了CNE1-LMP1细胞的EMT过程。Transwell凝胶侵袭实验则显示，经KLF8 siRNA干扰的CNE1-LMP1细胞侵袭性明显下降，提示KLF8在CNE1-LMP1细胞获得侵袭能力的过程中发挥重要作用，这都说明KLF8在鼻咽癌CNE1-LMP1细胞的EMT过程中发挥了一定的作用。
综上所述，KLF8在鼻咽癌CNE1-LMP1细胞中高表达，而下调KLF8的表达能够影响CNE1-LMP1细胞EMT过程，明显降低该细胞的高侵袭能力，说明KLF8在鼻咽癌细胞中的高表达与鼻咽癌侵袭转移关系密切，其相关信号通路有待进一步研究。
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图 1 CNE1、CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA的表达
Figure 1 Expression protein and mRNA of KLF8 in CNE1, CNE1-LMP1 cells
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图 2 KLF8 siRNA转染CNE1-LMP1细胞中KLF8蛋白和mRNA的表达
Figure 2 The protein and mRNA expression of KLF8 in KLF8 siRNA transfected CNE1-LMP1 cells
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图 3 KLF8 siRNA干扰CNE1-LMP1细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA表达
Figure 3 The protein and mRNA expression of E-cadherin, N-cadherin in KLF8-siRNA-transfected CNE1-LMP1 cells
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[1] Zhang L, Zhu YX, Wang Y, et al. Salvage surgery for neck residue or recurrence of nasopharyngeal carcinoma: a 10-year experience[J]. Ann Surg Oncol, 2011, 18(1): 233-8. doi: 10.1245/s10434-010-1292-9
[1] Zhang L, Zhu YX, Wang Y, et al. Salvage surgery for neck residue or recurrence of nasopharyngeal carcinoma: a 10-year experience[J]. Ann Surg Oncol, 2011, 18(1): 233-8. [2] 饶洁, 赵利容, 罗泊涛, 等. 上皮-间质转化及其在鼻咽癌中的作用研究进展[J]. 山东医药, 2014, 54(15): 92-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SDYY201415038.htm Rao J, Zhao LR, Luo BT, et al. The progression of epithelial mesenchymal transition and its effect in nasopharyngeal carcinoma[J]. Shandong Yi Yao, 2014, 54(15): 92-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SDYY201415038.htm
[2] 饶洁, 赵利容, 罗泊涛, 等. 上皮-间质转化及其在鼻咽癌中的 作用研究进展[J]. 山东医药, 2014, 54(15): 92-5. [Rao J, Zhao LR, Luo BT, et al. The progression of epithelial mesenchymal transition and its effect in nasopharyngeal carcinoma[J]. Shandong Yi Yao, 2014, 54(15): 92-5.] [3] 许明召, 刘宏旭, 崔贵. Kruppel样转录因子8的结构和功能多样性[J]. 中国医药导报, 2015, 12(12): 29-31. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YYCY201512009.htm Xu MZ, Liu HX, Cui G. Diversified function and structure of Krüppel-like factor 8[J].Zhongguo Yi Yao Dao Bao, 2015, 12(12): 29-31. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YYCY201512009.htm
[3] 许明召, 刘宏旭, 崔贵. Kruppel样转录因子8的结构和功能多样 性[J]. 中国医药导报, 2015, 12(12): 29-31. [Xu MZ, Liu HX, Cui G. Diversified function and structure of Krüppel-like factor 8[J]. Zhongguo Yi Yao Dao Bao, 2015, 12(12): 29-31.] [4] Knoedler JR, Denver RJ. Krüppel-like factors are effectors of nuclear receptor signaling[J]. Gen Comp Endocrinol, 2014, 203: 49-59. [4] Knoedler JR, Denver RJ. Krüppel-like factors are effectors of nuclear receptor signaling[J]. Gen Comp Endocrinol, 2014, 203: 49-59. doi: 10.1016/j.ygcen.2014.03.003
[5] 万伟峰, 朱继, 方升, 等. Krüppel样转录因子8(KLF8)的结构及功能[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2011, 27(4): 305-9. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SWHZ201104004.htm Wan WF, Zhu J, Fang S, et al. Structure and function of Krüppel-like factor 8[J]. Zhongguo Sheng Wu Hua Xue Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Bao, 2011, 27(4): 305-9. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SWHZ201104004.htm
[5] 万伟峰, 朱继, 方升, 等. Krüppel样转录因子8(KLF8)的结构及功 能[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2011, 27(4): 305-9. [Wan WF, Zhu J, Fang S, et al. Structure and function of Krüppel-like factor 8[J]. Zhongguo Sheng Wu Hua Xue Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Bao, 2011, 27(4): 305-9.] [6] Voulgari A, Pintzas A. Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1796(2): 75-90. http://cn.bing.com/academic/profile?id=fc032104bf86174462b0be1ff3819919&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[6] Voulgari A, Pintzas A. Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1796(2): 75-90. [7] 杨丽华, 沈星凯, 李静秋. 微RNA通过调节上皮间质转化影响肿瘤转移[J]. 遗传, 2014, 36(7): 637-45. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YCZZ201407004.htm Yang LH, Shen XK, Li JQ. MicroRNAs affect tumor metastasis through regulating epithelial-mesenchymal transition[J]. Yi Chuan, 2014, 36(7): 637-45. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YCZZ201407004.htm
[7] 杨丽华, 沈星凯, 李静秋. 微RNA通过调节上皮间质转化影响 肿瘤转移[J]. 遗传, 2014, 36(7): 637-45. [Yang LH, Shen XK, Li JQ. MicroRNAs affect tumor metastasis through regulating epithelial-mesenchymal transition[J]. Yi Chuan, 2014, 36(7): 637-45.] [8] 张莉, 沈丽佳, 谢思明. 影响E-钙黏蛋白表达下调因素与上皮- 间充质转化关系的研究进展[J]. 中外医学研究, 2014, 12(10): 158-60. [Zhang L, Shen LJ, Xie SM. The progression of the factors down-regulated E-cadherin relationship with Epithelialmesenchymal transition[J]. Zhong Wai Yi Xue Yan Jiu, 2014, 12(10): 158-60.] [8] 张莉, 沈丽佳, 谢思明. 影响E-钙黏蛋白表达下调因素与上皮-间充质转化关系的研究进展[J]. 中外医学研究, 2014, 12(10): 158-60. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YJZY201410094.htm Zhang L, Shen LJ, Xie SM. The progression of the factors down-regulated E-cadherin relationship with Epithelial-mesenchymal transition[J]. Zhong Wai Yi Xue Yan Jiu, 2014, 12(10): 158-60. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YJZY201410094.htm
[9] Shih W, Yamada S. N-cadherin as a key regulator of collective cell migration in a 3D environment[J]. Cell Adh Migr, 2012, 6(6): 513-7. [9] Shih W, Yamada S. N-cadherin as a key regulator of collective cell migration in a 3D environment[J]. Cell Adh Migr, 2012, 6(6): 513-7. doi: 10.4161/cam.21766
[10] 陈曦, 彭纲, 李跃华, 等. 鼻咽癌中E-cadherin和N-cadherin的表达及临床意义[J]. 肿瘤防治研究, 2014, 41(1): 27-30. http://www.zlfzyj.com/CN/abstract/abstract4428.shtml Chen X, Peng G, Li YH, et al. Expression and Clinical Significance of E-cadherin and N-cadherin in Nasopharyngeal Carcinoma[J]. Zhong Liu Fang Zhi Yan Jiu, 2014, 41(1): 27-30. http://www.zlfzyj.com/CN/abstract/abstract4428.shtml
[10] 陈曦, 彭纲, 李跃华, 等. 鼻咽癌中E-cadherin和N-cadherin的 表达及临床意义[J]. 肿瘤防治研究, 2014, 41(1): 27-30. [Chen X, Peng G, Li YH, et al. Expression and Clinical Significance of E-cadherin and N-cadherin in Nasopharyngeal Carcinoma[J]. Zhong Liu Fang Zhi Yan Jiu, 2014, 41(1): 27-30.] [11] 张薇薇, 戴德. EB病毒潜伏膜蛋白1与鼻咽癌关系的研究进展[J]. 海南医学, 2010, 21(10): 101-4. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HAIN201010051.htm Zhang WW, Dai D. The progression of EB virus latent membrane protein 1 and nasopharyngeal carcinoma[J]. Hainan Yi Xue, 2010, 21(10): 101-4. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HAIN201010051.htm
[11] 张薇薇, 戴德. EB病毒潜伏膜蛋白1与鼻咽癌关系的研究进 展[J]. 海南医学, 2010, 21(10): 101-4. [Zhang WW, Dai D. The progression of EB virus latent membrane protein 1 and nasopharyngeal carcinoma[J]. Hainan Yi Xue, 2010, 21(10): 101-4.] [12] 苟新敏, 陈燕, 陈小毅. EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响[J]. 癌症, 2003, 22(5): 481-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-AIZH200305007.htm Gou XM, Chen Y, Chen XY. Effects of epstein-barr virus latent membrane protein 1(EBV-LMP1) on related factors of metastasis of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1[J]. Ai Zeng, 2003, 22(5): 481-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-AIZH200305007.htm
[12] 苟新敏, 陈燕, 陈小毅. EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转 移相关因素的影响[J]. 癌症, 2003, 22(5): 481-5. [Gou XM, Chen Y, Chen XY. Effects of epstein-barr virus latent membrane protein 1(EBV-LMP1) on related factors of metastasis of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1[J]. Ai Zeng, 2003, 22(5): 481-5.]
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