叉头框（forkhead box，Fox）蛋白家族是一类转录因子家族，其DNA结合区具有一个高度保守的翼状螺旋结构。根据DNA结合区的同源性，目前将该蛋白家族分为19个亚群（从FoxA到FoxS）^{[1, 2]}，FOX蛋白作为转录因子调控诸多下游基因的表达，参与包括细胞周期、增殖、分化、凋亡、衰老及其肿瘤的浸润及转移等生物学进程，与细胞命运的转归和肿瘤的发生发展息息相关^[3]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒（avian erythroblastic leukemia viral,v-erb-b）致癌基因同源体，EGFR基因的过度表达能促进正常细胞的转化和肿瘤细胞的转移，EGFR信号通路在肿瘤的形成和发展过程中占据重要地位^[4]。本研究组在前期工作中构建了基于shRNA慢病毒干扰系统的FOXQ1基因沉默DLD1大肠癌细胞株^[5]，本研究中应用该细胞株就FoxQ1与EGFR基因的相关性进行了初步探讨，为进一步研究FoxQ1基因在EGFR信号通路中的作用及分子机制奠定实验基础。

EGFR酪氨酸激酶抑制剂盐酸埃罗替尼（Erlotinib HCl）购自Selleck公司（美国）；EGFR siRNA购自Santa Cruz公司（美国）；大肠癌细胞系DLD1、HT29、LOVO、HCT116和人胚肾细胞293-T均购自中国科学院细胞库；RPMI 1640培养液及0.05%胰蛋白酶均购自Hyclone公司（美国）；澳洲特级胎牛血清及青霉素-链霉素溶液购自BioInd公司（以色列）；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司（美国）；Biozol购自Biomiga公司（美国）；GoScontrolipt^TM Reverse Transcontroliption System试剂盒购自Promega公司（美国）；SYBR Premix Ex TaqⅡ购自TaKaRa公司（日本）；6孔细胞培养板及25 cm²细胞培养皿购自BD Falcon公司（美国）；RNA浓度测定所用仪器为NanoDrop（美国）；实时定量PCR扩增仪为罗氏LightCycler 480（瑞士）。

根据FOXQ1基因序列设计引物，上游引物FOXQ1-F：5’-GGCAACGGGCTACAGCTTTA-3’，下游引物FOXQ1-R：5’-GGCACCCCACATACATAATCAA-3’。EGFR基因上游引物EGFR-F：5’-ATGCTCTACAACCCCACCAC-3’，下游引物EGFR-R：5’-GCCCTTCGCACTTCTTACAC-3’。GAPDH作为内参基因，上游引物GAPDH-F：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物GAPDH-R：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

分别接种大肠癌细胞DLD1、HT29、HCT116、LOVO和人胚肾细胞293-T于6孔板中，每孔3×10⁵个细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液于5%CO₂、37℃培养箱培养48 h。

接种DLD1细胞于6孔板中，每孔3.5×10⁵个细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（不含双抗）于37℃、5%CO₂培养箱培养24 h后，分别加入终浓度为30、50 μg/ml的Erlotinib HCl继续培养DLD1细胞72 h。 实验分组为：DLD1细胞；终浓度为30 μg/ml的Erlotinib HCl处理的DLD1细胞（EGFR-inhibitor-30/DLD1）；终浓度为50 μg/ml的Erlotinib HCl处理的DLD1细胞（EGFR-inhibitor-50/DLD1）。

接种DLD1-shRNA-FoxQ1细胞于6孔板，每孔3.5×10⁵个细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（不含双抗）于37℃、5%CO₂培养箱培养24 h后，以2 μg/5 μl siRNA-EGFR/Lipofectamine 2000转染各组细胞6 h后弃去转染上清液，重新加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液继续培养48 h。实验所用细胞：①：DLD1-shRNA-Control为不含siRNA-FOXQ1序列的空载体慢病毒干扰的DLD1细胞；②：DLD1-shRNA-FoxQ1为经shRNA-FoxQ1慢病毒干扰的DLD1细胞。实验分组：对照组：①和②细胞；siRNA-EGFR转染组：经siRNA-EGFR转染的①细胞（siRNA-EGFR/DLD1-shRNA-Control）和经siRNA-EGFR转染的②细胞（siRNA-EGFR/DLD1-shRNA-FoxQ1）。

接种DLD1-shRNA-FoxQ1细胞于6孔板，每孔3.5×10⁵个细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（不含双抗）于37℃、5%CO₂培养箱培养24 h后，以终浓度为50 μg/ml的Erlotinib HCl处理各组细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液继续培养72 h。实验所用①和②细胞同1.2.4。实验分组为：对照组：①和②细胞；Erlotinib HCl处理组：经Erlotinib HCl处理的①细胞（EGFR-inhibitor/DLD1-shRNA-Control）和经Erlotinib HCl处理的②细胞（EGFR-inhibitor/DLD1-shRNA-FoxQ1）。

用Biozol裂解各组细胞，提取细胞总RNA，取2 μg RNA经Promega反转录试剂盒反转录获得cDNA，取2 μl cDNA，应用SYBR Green及实时定量PCR扩增仪扩增FOXQ1及EGFR基因，收集荧光信号，用2^-ΔΔCt法计算FOXQ1及EGFR基因在各组细胞中的相对表达量。

实验所得数据采用（x±s）表示，各组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间差异显著性检验，以P<0.05为差异用统计学意义。

荧光定量PCR检测结果显示，以293-T细胞中FoxQ1相对表达量为1作为对照，FoxQ1在DLD1、HT29、LOVO、HCT116中的相对表达量分别为83.09、59.58、0.06、0.03，FoxQ1在DLD1中的相对表达量最高，其次是HT29，而在HCT116和LOVO中的相对表达量极低（DLD1-HT29：P=0.009，DLD1-LOVO：P=0.000，DLD1-HCT116：P=0.000），见图 1。 以293-T细胞中EGFR相对表达量为1作为对照 ，EGFR在DLD1、 HT29、LOVO、HCT116中的相对表达量分别为4.95、3.67、2.08、1.36，EGFR在DLD1中的相对表达量最高，其次是HT29，在LOVO和HCT116中也有表达，但显著低于DLD1和HT29（DLD1-HT29：P=0.028，DLD1-LOVO：P=0.003，DLD1-HCT116：P=0.000），见图 2。大肠癌细胞系中FoxQ1与EGFR基因的表达趋势基本一致。

**: P<0.01, compared with DLD1 cells 图 1 FoxQ1 mRNA在大肠癌细胞系中的相对表达量 Figure 1 FoxQ1 mRNA relative expression in colorectal cancer cell line

图选项

*: P<0.05, **: P<0.01, compared with DLD1 cells 图 2 EGFR mRNA在大肠癌细胞系中的相对表达量 Fig. 2 Epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA relative expression in colorectal cancer cell line

图选项

荧光定量PCR检测结果显示，DLD1细胞经不同浓度Erlotinib HCl处理阻断EGFR酪氨酸激酶后，EGFR表达量降低，但在Erlotinib HCl浓度为30和50 μg/ml时差异无统计学意义；而FoxQ1的表达量经Erlotinib HC处理后均升高，且在Erlotinib HCl浓度为50 μg/ml时显著高于30 μg/ml（P=0.000），见图 3。

**: P<0.01, pairwise compared with DLD1 cells 图 3 不同浓度EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl处理的DLD1细胞中FoxQ1及EGFR基因mRNA相对表达量 Fig. 3 FoxQ1 and EGFR mRNA relative expression in DLD1 cells treated with different concentrations of Erlotinib HCl

图选项

荧光定量PCR结果显示：（1）DLD1-shRNA-Control和DLD1-shRNA-FoxQ1组间比较：在空白对照组、siRNA-EGFR和EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl处理组中，FoxQ1的表达在DLD1-shRNA-FoxQ1细胞较DLD1-shRNA-Control细胞均极显著降低（P=0.002、0.001、0.002），而EGFR表达在DLD1-shRNA-FoxQ1细胞较DLD1-shRNA-Control细胞均极显著增高（P=0.000、0.002、0.002）。（2）DLD1-shRNA-Control组内比较： DLD1-shRNA-Control细胞经siRNA-EGFR和EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl处理组分别与空白对照组相比，EGFR表达量均极显著降低（P=0.003、0.002），而FoxQ1基因表达量均显著增高（P=0.043、0.002）。（3）DLD1-shRNA-FoxQ1组内比较：DLD1-shRNA-FoxQ1细胞经siRNA-EGFR处理后，EGFR表达量的降低与空白对照组相比无统计学意义，FoxQ1的升高与空白对照组相比亦无统计学意义；但EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl处理组与空白对照组相比，EGFR表达量反而极显著升高（P=0.007），FoxQ1基因的表达量也显著升高（P=0.041），见图 4。

**: P<0.01: compared between DLD1-shRNA-Control and DLD1-shRNA-FoxQ1 groups: Δ: P<0.05, ΔΔ: P<0.01: compared within DLD1-shRNA-Control groups; #: P<0.05, ##: P<0.01: compared within DLD1-shRNA-FoxQ1 groups 图 4 FoxQ1 mRNA在各处理组细胞中的相对表达量 Fig. 4 FoxQ1 mRNA relative expression in each treatment group

图选项

人FoxQ1基因定位于人体6号染色体短臂25.3区（6p25.3），全长2 319 bp，仅含1个外显子，编码403个氨基酸，其功能可以稳定结合靶基因启动子区域的GC盒等核心元件，控制基因转录活性而发挥生物效应^[6]。 FoxQ1作为叉头框蛋白转录因子家族中的一员，生物学功能涉及毛囊形成和胃上皮的分化^[7]，参与胃酸分泌和黏蛋白基因的表达^[8]。FoxQ1转录因子能结合到E-钙黏蛋白（E-cadherin,ECD）基因启动子区的E-box并抑制其表达，诱导上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）^[9]。近年研究发现FoxQ1基因在人类肿瘤包括大肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌中异常表达 ，并促进肿瘤转移 ^{[10, 11, 12, 13]}。

人EGFR基因位于第7号染色体p13~q22区，全长200 kb，由28个外显子组成，编码1 186个氨基酸，其糖蛋白相对分子质量约170 kDa^[14]，与HER2/ErbB-2/Neu/p185、HER3/ErbB-3、HER4/ErbB-4等被归入HER/ErbB家族，同属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTKs）。其配体通过与EGFR胞外结构特异性结合，激活EGFR的酪氨酸激酶活性，通过催化与肌醇磷代谢有关的酶、激酶、调节蛋白磷酸化，促进产生第二信使，导致核内原癌基因c-fos、c-myc表达，刺激肿瘤细胞生长增殖、黏附、侵袭和转移^[15]。 EGFR通路近膜信号经过细胞质中各种衔接蛋白、酶等的级联反应到达核内，最主要的信号通路包括MAPK通路、PI3K通路或c-Src通路。Akt是PI3K下游一个重要的靶分子，通过使大量蛋白（包括调节FasL表达、Forkhead家族转录因子、caspase-9、GSK-3β、NF-κB）的磷酸化来调控细胞的存活和凋亡^[16]。如Akt磷酸化FoxO的丝氨酸/苏氨酸残基，磷酸化的FoxO与DNA的亲和力下降，并从细胞核转移到细胞质，与细胞质中的伴侣蛋白14-3-3蛋白结合，阻止FoxO逆转运至细胞核内，从而抑制FoxO转录活性，Akt活性降低时，FoxO发生去磷酸化，FoxO进入细胞核内，转录活性被激活，并结合靶基因对应的DNA靶向序列，行使其转录功能^{[17, 18]}。

然而，FoxQ1在肿瘤组织中的异常表达与EGFR-PI3K-Akt通路之间是否存在相关性，目前尚无文献报道。在本研究中，发现FoxQ1和EGFR基因的表达趋势在多个大肠癌细胞系中趋于一致，但是将DLD1细胞的FoxQ1基因敲低后，EGFR的表达反而升高。为了解释这一现象，进一步运用RNA干扰和化学抑制剂，分别在转录水平和酪氨酸激酶水平上对EGFR的表达及其蛋白的活化进行干扰。

在进行DLD1-shRNA-Control和DLD1-shRNA-FoxQ1组间比较、DLD1-shRNA-Control组内比较时，发现这样一种现象，当FoxQ1的表达被敲低后，EGFR的表达升高；EGFR受siRNA干扰及其酪氨酸激酶活性被抑制后，FoxQ1的表达均升高。这一结果提示，在大肠癌中FoxQ1与EGFR基因之间可能存在相互负反馈调节机制，当FoxQ1表达被抑制后，EGFR-FoxQ1轴所涉及的某些基因会被激活或抑制，从而负反馈调节EGFR基因，促使其表达升高；反之，在EGFR的表达或蛋白激酶活性被抑制后，EGFR-FoxQ1轴所涉及的某些基因被激活或抑制，从而促使FoxQ1表达升高。并且，在DLD1-shRNA-FoxQ1组内比较时，EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl处理组与空白对照组相比，EGFR表达量显著升高，FoxQ1基因的表达量也显著升高，提示虽然DLD1-shRNA-FoxQ1细胞中EGFR蛋白活性被抑制，但因FoxQ1表达被敲低，EGFR mRNA表达水平与DLD1-shRNA-FoxQ1细胞空白对照组相比反而明显升高，但因DLD1-shRNA-FoxQ1细胞中EGFR蛋白活性被抑制，FoxQ1 mRNA的表达水平与DLD1-shRNA-FoxQ1细胞空白对照组相比有所升高。此现象进一步验证了EGFR与FoxQ1基因之间存在相互负反馈调控机制的可能性。

EGFR-FoxQ1轴所涉及的基因是哪些，这些基因又是通过何种分子机制调控大肠癌细胞中EGFR及FoxQ1基因的表达，维持两者的高表达状态，并最终促进大肠癌的发生发展，这些问题将是我们今后的研究重点。