腹膜癌（peritoneal carcinoma,PC）是在腹膜上发生发展的一类恶性肿瘤，95%以上的PC为继发性腹膜癌，其原发肿瘤多源自胃、结直肠和卵巢^[1]。腹膜癌发生的最主要部位是大网膜^[2]，这与其特殊微环境乳斑（milky spots,MS）关系密切。乳斑是癌细胞选择性定植部位，其特殊形态利于腹腔游离癌细胞黏附、存活和增殖，形成微转移灶，促进PC发生发展。

本研究采用HE染色和免疫组织化学法，分析乳斑的形态学特征和细胞数量，进而分析乳斑内细胞成分（间皮细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和血管内皮细胞）的组成比例和位置关系，以在组织学和细胞学水平认识乳斑，研究腹膜癌的病理机制。

收集武汉大学中南医院肿瘤科2014年5月至11月确诊的腹膜癌患者病理标本20例，其中9例结直肠癌PC，4例原发性PC，3例胃癌PC，3例妇科肿瘤PC，1例阑尾黏液瘤PC；男性占40%（8/20），女性占60%（12/20）,男女之比为1:1.5，平均年龄50岁（24~71岁）。选取其中1例胃癌PC和1例直肠癌PC标本制备病理切片，作为研究对象。研究病例均经患者知情同意和医院伦理委员会批准，有完整的临床病理记录。

标本经3%多聚甲醛常温固定24 h，丙酮脱脂10 h，甲醛再固定24 h，于网膜硬化部位取材，石蜡包埋，制备病理切片。常规组织4 μm厚连续切片，60℃烤片2 h，二甲苯中脱蜡3次，每次5 min。无水乙醇浸泡5 min，然后再分别用95%乙醇浸泡2次，每次2 min，85%乙醇冲洗1次2 min，自来水冲洗5 min，蒸馏水冲洗3 min。切片置于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波98℃修复20 min。室温下冷却30 min，蒸馏水冲洗。

3%H₂O2室温下孵育10 min，消除内源性过氧化物酶。每张切片用2%牛血清蛋白（BSA）37℃封闭30 min，防止抗原与抗体非特异性结合。倾去BSA，滴加一抗，37℃孵育2 h。TBS 冲洗3次，每次5 min，滴加相应二抗，37℃孵育15 min，用过氧化物酶标记的链霉素孵育15 min（福州迈新生物技术开发有限公司，中国）。用PBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液（丹麦DAKO公司）显色，显微镜下观察显色反应，显色适度时终止反应。自来水充分冲洗，苏木精对比染色，封片。阴性对照组的一抗用TBS替代。其中，免疫组织化学实验使用的一抗见表 1 。

表 1 免疫组织化学实验所用一抗 Table 1 Primary antibodies used for immunochemistry experiment

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图像采集系统为Olympus BX51荧光显微镜，配备Olympus DP72照相机（Olympus Optical Co.,Ltd.,Japan）。在显微镜明场下，分别于“10×”、“20×”、“40×”视野观察切片，识别免疫细胞集中区作为乳斑。

在光学显微镜下（×400）观察HE切片，绘制乳斑边界，分析形态特征，计算不同形态的比例。采用Otsu阈值分割方法，通过计算机把乳斑HE图片转换成二值图像^[3]（图 1F），并读取每张图片中乳斑边界的像素值，作为描述其周长的参数。

The yellow frame was used to show the gross morphology of MS: (A) round,(B) oval,(C) irregular form in adipose tissues,(D) perivascular annulus,(E-F) using computer methods to convert HE images into binary images for calculating MS perimeter. The region in the read border indicated MS; (G) Proportions of MS shapes; H,I: Comparison of MS cells number and perimeter between GC and RC groups,respectively; A-F: ×400,scale bar=20 μm). HE: hematoxylin-eosin; MS: milky spots; GC: gastric cancer; RC: rectal cancer 图 1 HE染色分析乳斑细胞形态、数量和大小 Figure 1 Milky spots(MS) cells morphology,number and size analyzed by HE staining

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间皮细胞、淋巴细胞染色结果显示细胞轮廓清晰，直接读取相应乳斑区的细胞数值，用中位数和范围表示。CD68染色的巨噬细胞形态不规则，为定量分析，采用Imagepro Plus 6.0^[4]软件（IPP,Media Cybernetics,Inc.,USA）对乳斑区进行分色处理，棕色的巨噬细胞被标记为一种颜色，称为目标区域（areas of interesting,AOI），乳斑区其他细胞被标记为另一种颜色，分别计算两种颜色的吸光度值，巨噬细胞百分比=巨噬细胞区域的吸光度值/总体吸光度值×10⁰%。参照Weidner等^[5]报道的方法，计数微血管密度（microvessel density,MVD）。

使用SPSS21.0软件进行统计学分析，计算乳斑区各细胞成分的中位数，胃癌（gastric cancer,GC）组和直肠癌（rectal cancer,RC）组不同参数的比较使用两独立样本非参数检验（Mann-Whitney U检验），P <0.05为差异有统计学意义。

HE染色共分析200个乳斑，其中GC组100个，RC组100个，发现乳斑形态学上可分为圆形（14.5%）、椭圆形（18.0%）、脂肪内不规则形（14.0%）、血管周环形（11.5%）、血管周聚集形（9.0%）、扇形（4.5%）、梭形（8.5%）和网膜缘弧形（5.5%）等，以前4种形态为主，依次见图 1A~1F。RC组乳斑多位于网膜边缘，但该现象在GC组不明显。乳斑内血管丰富，免疫细胞聚集成团成簇，排列紧密。

GC组乳斑的细胞数为130（43~520）个，RC组为145（45~650）个，两者差异无统计学意义（P=0.187）。GC组乳斑周长为2545（1104~4836）像素，RC组为2783（817~7753）像素，见表 2、图 1H、1I，两者差异无统计学意义（P=0.125）。

表 2 网膜乳斑形态参数的定量分析 Table 2 Quantitative analysis on morphological parameters of omental milky spots

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间皮细胞位于乳斑表层，覆盖在免疫细胞和血管的上层，与免疫细胞总数之比约为1:28，排列疏松，常形成细胞缺失区，即乳斑小孔（图 2E），是乳斑与腹腔联系的通道。GC组乳斑间皮细胞数为7（0~17）个，RC组为5（0~51）个，差异无统计学意义（P=0.793）。

A: Macrophages were diffusely distributed within MS; B,C: Lymphocytes were located intensively in particular position. The location of T lymphocytes was roughly complementary with B lymphocytes,as shown by the yellow frame; D: Black arrows indicated microvessels in MS,while red arrows indicated vessels diameter > 8 red blood cells; E: Red arrows indicated mesothelial cells stained by Calretinin. Triangular red arrows indicated the stomata of MS. Mesothelial cells were arranged loosely in E1,and compactly in E2; F: Different cellular components of MS between GC and RC patients; A1-D1: ×200,scale bar=50 μm; A2-E2: ×400,scale bar=20 μm; IHC: immunohistochemistry (A: macrophages; B: T lymphocytes; C: B lymphocytes; D: vascular endothelial cells; E: mesothelial cells) 图 2 网膜乳斑内不同细胞成分的免疫组织化学染色结果 Figure 2 网膜乳斑内不同细胞成分的免疫组织化学染色结果

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乳斑中巨噬细胞呈弥散分布（图 2A），大小不一，形态不规则，不同乳斑内巨噬细胞的含量差异大，占所有免疫细胞的10%~40%。GC组巨噬细胞占所有免疫细胞的14.7%（0.6%~75.8%），RC组为10.7%（2.0%~56.0%），组间比较，差异无统计学意义（P=0.897）。

T细胞聚集分布，细胞团位于乳斑局部，其余区域为CD3染色阴性的细胞（图 2B）。GC组乳斑内T细胞数为57（20~146）个，RC组为68（17~280）个，两组差异无统计学意义（P=0.102）。

B细胞分布与T细胞类似，细胞团位于乳斑局部，大致与T细胞区域互补（图 2C）。GC组乳斑内B细胞数为21（7~100）个，RC组为66（7~220）个，两组差异有统计学意义（P<0.001）。

微血管主要位于乳斑内层（图 2D），GC组乳斑MVD值为4（0~11）个，RC组该值为5（0~13）个，两组差异无统计学意义（P=0.358）。

汇总以上实验结果，列出乳斑形态学参数表，见表 2、图 2F。基于HE染色得出乳斑免疫细胞总数，IHC染色结果提示乳斑内免疫细胞成分为：T淋巴细胞占46.1%、B淋巴细胞占28.4%、巨噬细胞占12.4%，其他免疫细胞成分占13.1%。

腹膜癌是腹腔内肿瘤的区域性转移，最常见转移部位为大网膜。转移癌的形成需要癌细胞和肿瘤微环境协同作用^{[6, 7, 8]}。网膜微环境存在初级免疫组织乳斑^[9]，“种子-土壤”学说^[10]提示癌细胞自原发灶脱落成为腹腔游离癌细胞，保持侵袭性并游走，最终选择性种植于乳斑。乳斑内细胞成分与癌细胞存在紧密而动态变化的相互作用，不同细胞的数量比例和位置关系是腹膜癌发生发展的结构基础。

本研究以腹膜癌患者网膜组织的病理切片为研究对象，采用HE染色分析乳斑形态特征，结果发现其中以圆形和椭圆形乳斑为主，细胞数多在300以上，其他形态均不规则，细胞数较少。Gerber等^[11]发现小鼠腹腔内注射肿瘤细胞后，乳斑淋巴细胞数不断减少，8天后仅有少量细胞散布在肿瘤微转移灶内。这提示圆形或椭圆形是乳斑的早期完整形态，早期乳斑可杀伤肿瘤细胞，抗肿瘤作用占主导，随着成熟肿瘤细胞不断凋亡，残留的肿瘤干细胞抵抗免疫杀伤，释放多种趋化因子并形成新生血管，实现免疫逃逸^[12]，仍能持续增殖、分化。早期乳斑数的减少提示腹膜癌进展，形成微转移灶，乳斑细胞数骤减，形态发生变化，或呈不规则形（如梭形），或出现细胞排列分散的现象（如血管周环形）。

免疫组织化学法研究乳斑细胞的位置关系，发现T细胞和B细胞均聚集成细胞簇，位置关系大致互补，提示乳斑早期发挥抗肿瘤作用时，具有区域性免疫增强的特点。乳斑巨噬细胞弥散分布在其内部以及与周围组织的交界处，而微血管也多位于乳斑内层。Krist等^[13]在电子显微镜下观察发现，不成熟的巨噬细胞分布在乳斑中央，成熟型分布在表层。不同位置的巨噬细胞作用不同，如在缺氧区域的巨噬细胞能促进肿瘤血管形成，而在肿瘤-间质交界处则能促进癌细胞侵袭^[14]。这也提示乳斑既可促进癌细胞侵袭，也可促进其增殖，是癌细胞选择性种植网膜乳斑的原因之一。乳斑内巨噬细胞的分型和作用机制尚需进一步研究。

胃肠道肿瘤是腹膜癌最常见的原发肿瘤^{[15, 16]}。本实验研究对象为出现腹膜转移的胃癌和直肠癌患者，我们选取未见癌细胞转移的网膜区乳斑，在细胞水平对其定量分析，旨在获得肿瘤负荷状态下乳斑的基础数据。癌细胞侵袭后乳斑的相关研究有待进一步开展。Krist等^[13]研究7例腹腔内无感染和肿瘤患者的网膜乳斑，其结果提示乳斑的细胞学组成中，巨噬细胞占67.9%，B细胞占10.1%，T细胞占10.2%，其余为肥大细胞。本实验纳入研究患者的网膜状态与之不同，采用免疫组织化学技术研究的乳斑数量更多，使用的单克隆抗体对白细胞表面抗原的识别更加精确。结果提示乳斑内层免疫细胞中位数为141个，其中T细胞占46.1%，B细胞占28.4%，巨噬细胞占12.4%。

总之，免疫组织化学法可以分别对各指标做定量分析，初步得出乳斑形态学特征、细胞组成比例和位置关系，但不能原位、同步获取多种信息的综合数据。量子点在肿瘤分子成像方面优势明显^{[17, 18]}，结合该方法深入研究乳斑特征有助于认识腹膜癌的形成过程，为腹膜癌分类分期提供依据，这是我们下一步的研究方向。