研究发现，肿瘤微环境在肿瘤的疾病进程中发挥着重要的作用，微环境中的炎症细胞、间质细胞等可分泌多种细胞因子调节肿瘤细胞的生长、分化、远处转移及血管生成等一系列病理生理功能^{[1, 2, 3]}。外泌小体（exosome）作为近年来研究的热点，被认为是潜在的诊断标志和治疗靶点。exosome也称为小囊体或小囊泡，直径为30~100 nm，虽然是细胞外泌囊泡中体积较小的一种，但其中包含蛋白质及RNA等多种物质。研究表明，间质细胞可以通过分泌exosome激活乳腺癌细胞中的STAT1及NOTCH信号通路，调节肿瘤的化疗敏感度；exosome也有望作为非小细胞肺癌新的治疗靶点及临床诊断标志^{[4, 5, 6]}。虽然既往研究表明exosome是肿瘤微环境中重要的组成部分，但究竟是通过其中的哪种蛋白或RNA分子调控肿瘤的生物学进程，目前尚不十分清楚。本研究通过小鼠成纤维细胞系3T3来源的exosome作为研究工具，以三阴性（雌、孕激素及表皮生长因子受体2表达均为阴性）小鼠乳腺癌细胞4T1作为实验模型，观察exosome对乳腺癌细胞增殖的影响，并探索其中可能的机制。

小鼠成纤维细胞3T3及小鼠乳腺癌细胞4T1购自中科院上海细胞库。PureExo Exosome提取试剂盒、CCK8检测试剂盒及BrdU/PI双掺入检测试剂盒购自武汉启动子生物有限公司。抗人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）、下游PI3K/AKT信号转导通路p-AKT(308)、p-AKT(473)、AKT及内参GAPDH抗体均购自上海优宁维生物有限公司。HER2特异性siRNA及各基因PCR引物由武汉擎科生物有限公司设计并合成，引物序列为：HER2：上游引物：5’-GAGACAGAGCTAAGGAAGCTGA-3’，下游引物：5’-ACGGGGATTTTCACGTTCTCC-3’，GAPDH：上游引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。HER2单克隆抗体靶向药物赫赛汀（Herceptin）购自美 国 基因科技中国分公司。

小鼠3T3及4T1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO₂培养箱内常规传代培养。

小鼠3T3细胞培养至对数生长期，收集10 ml上清液，低速离心去掉沉淀杂质，按照PureExo Exosome提取试剂盒说明书提取exosome。透射电镜观察、Western blot检测exosome特有的分子标志CD81，BCA法定量exosome的浓度。另将4T1细胞接种至6孔板及96孔板，大约至50%左右融合度，加入不同浓度的exosome继续培养，不同的时间点收集细胞行后续实验。无菌PBS漂洗5次。按照试剂盒说明书提取exosome中总RNA，qPCR检测其中HER2及内参GAPDH的mRNA水平。

不同浓度exosome处理后的4T1细胞，分别于0、24、48、72及96 h后按照CCK-8试剂盒说明书，每孔加入10%的CCK8溶液，继续孵育4 h后，利用酶标仪在450 nm处测定吸光度值并绘制曲线，每组设5个复孔，实验重复3次。

不同浓度exosome处理96 h后的4T1细胞掺入BrdU（10 μmol/L）30 min，PBS漂洗，75%冰乙醇固定过夜后，2 mol/L盐酸破膜打孔40 min，0.1 mol/L四氢硼砂中和，并依此孵育BrdU一抗、二抗及PI后行流式细胞仪检测，实验重复3次。

blot）实验 不同浓度的exosome作用96 h后，每组各收集1×10⁶个细胞，裂解获取细胞总蛋白，各样品通过BCA法检测蛋白浓度，各蛋白样品按照上述检测所得浓度分别取50 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，依次孵育一抗及二抗最后用ECL显色液显影检测细胞中HER2、p-AKT(308)、p-AKT(473)和AKT的蛋白水平变化，以GAPDH作为内参，实验重复3次。

不同浓度的exosome作用4T1细胞96 h后，每组各收集1×10⁶个细胞，通过TRIzol一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，应用上述引物行PCR扩增，ABI7300检测并分析各细胞中HER2的mRNA水平，以GAPDH作为内参，每组设3个复孔，实验重复3次。exosome中HER2及GAPDH的总RNA按说明书提取。

用SPSS12.0统计学软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

本研究得到武汉中心医院医学伦理委员会的批准。

通过CCK8试剂盒法检测细胞增殖，结果提示exosome处理4T1细胞后，细胞增殖加快：0 h时各组细胞吸光度差异无统计学意义，24 h时200 μg/ml exosome处理组（0.61±0.04）高于对照组（0.23±0.03），P<0.05，48 h时200 μg/ml exosome处理组（0.95±0.03）明显高于对照组（0.46±0.02），差异有统计学意义（P<0.05）；72、96 h时exosome各浓度组与对照组相比，均有明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。而BrdU/PI双掺入实验中，随着exosome浓度的升高，4T1细胞BrdU阳性细胞即处于DNA复制的S期细胞比例逐渐增多，见图 1~2，而处于G0/G1期的细胞比例明显减少，见图 2。

表 1 exosome对4T1细胞增殖的影响 Table 1 Effect of exosome on proliferation of 4T1 cells

表选项

*：P＜0.05, compared with control group 图 1 exosome对4T1细胞DNA合成的影响 Figure 1 Effect of exosome on DNA systhesis of 4T1 cells

图选项

图 2 不同浓度exosome对4T1细胞周期的影响 Figure 2 Effect of exosome on cell cycle of 4T1 cells

图选项

Western blot及qPCR结果提示，随着exosome浓度的提高，4T1细胞中HER2水平逐渐升高，而且Western blot结果提示HER2增高的同时伴随着AKT磷酸化水平明显升高；而转染HER2的特异性siRNA，干预HER2的表达后可抑制AKT的磷酸化水平，见图 3~4。

图 3 Western blot检测exosome对4T1细胞中HER2表达及PI3K/AKT信号通路活性的影响 Figure 3 Effect of exosome on expression of HER2 and activity of PI3K/AKT signal pathway in 4T1 cells observed by Western blot

图选项

n=3, *：P＜0.05, compared with control group 图 4 qPCR检测不同浓度exosome对4T1细胞HER2 mRNA水平的影响 Figure 4 Effect of exosome on HER2 mRNA level in 4T1 cells observed by qPCR

图选项

CCK8实验表明单独Herceptin对4T1细胞无明显杀伤作用，Herceptin作用后4T1细胞的增殖无显著变化，而同时给以200 μg/ml 的exosome处理细胞后，4T1细胞对Herceptin的敏感度明显增加，48 h开始出现统计学差异，差异最显著的96 h 时仅有约13% 4T1细胞存活，杀伤率达87%，见图 5。

n=5. *: P＜0.05, compared with control group 图 5 exosome对Herceptin治疗4T1细胞敏感度的影响 Figure 5 Effect of exosome on sensitivity of 4T1 cells to Herceptin treatment

图选项

近年来随着肿瘤分子生物学研究的深入，人们发现肿瘤微环境在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，肿瘤周围浸润着大量的炎症细胞及间质细胞可分泌exosome，通过胞吞作用进入肿瘤细胞中，调节肿瘤细胞的生长、运动及分化潜能。肿瘤细胞也可分泌exosome改变间质细胞尤其是免疫细胞对肿瘤的免疫监视及免疫应答^{[7, 8, 9]}。而乳房组织中除乳腺腺体外，还含有大量脂肪细胞及纤维结缔细胞，那么这些间质细胞是否能通过分泌exosome影响乳腺上皮细胞中HER2等蛋白的表达，尚未知晓。本实验以小鼠的成纤维细胞3T3作为材料，利用试剂盒法提取的exosome处理小鼠乳腺癌4T1细胞，观察对其增殖及HER2表达的影响。

本研究发现，exosome可以明显促进4T1细胞从G0/G1期进入S期，从而加快肿瘤细胞周期进程并促进细胞增殖，说明exosome中含有某些可以正向调控细胞周期的蛋白或者RNA分子。因此再利用Western blot及qPCR检测exosome处理96 h后4T1细胞中HER2的表达（图 3~4），发现HER2的表达随着exosome浓度的增加而逐渐增高，提示exosome中可能含有HER2并通过其促进细胞增殖。进一步检测HER2下游PI3K/AKT信号通路，发现AKT磷酸化水平也随着exosome浓度的增加而明显增高，意味着exosome可以通过HER2激活4T1细胞的PI3K/AKT信号通路。检测exosome中HER2的mRNA水平，证实exosome确实存在HER2的RNA分子。进一步使用HER2的特异性单克隆抗体曲妥珠单抗即Herceptin，发现exosome可明显增加4T1细胞对Herceptin的敏感度。

综上所述，本研究发现，小鼠成纤维细胞系3T3来源exosome可促进小鼠乳腺癌细胞4T1增殖，加快其细胞周期进程，并且可能通过使4T1外源性获得HER2表达，从而激活其下游PI3K/AKT信号通路； exosome可以增强4T1细胞对Herceptin的治疗敏感度。本研究提示可针对exosome开发新的药物或抑制剂，有可能为乳腺癌的临床治疗开辟新的方向。当然目前针对exosome的研究仍仅限于实验室阶段，今后尚需进一步阐明exosome在肿瘤微环境复杂信号通路中的作用和意义；同时如何提高exosome检测敏感度、降低检测成本的问题也亟待解决。