急性白血病（acute leukemia,AL）是一种常见的血液系统恶性肿瘤。成人AL的治疗仍面临着巨大的挑战。虽然联合化疗已使急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的疗效明显提高，但5年及10年生存率仅为21.4%和 18.7% ^[1]。难治复发性AML的预后较差，多数报道其单纯化疗的完全缓解（complete remission,CR）率在30%~50%之间，生存期短^{[2, 3, 4]}。如成功的补救化疗并尽早行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，all-HSCT），其3年无病生存率（DFS）仅达到19%^[5]。如果在不缓解的状态下强行移植，移植成功率明显下降，患者长期无病生存率也仅为10%左右。因此，在造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）前需要达到CR患者才能获得较好的预后^[6]。同样，难治/复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）预后也较差，即使给予有效的补救治疗后，完全缓解率仅20%~50%，且缓解期大多维持在4月以内^[7]。因此，难治/复发AL的治疗已成为白血病治疗中急需解决的难题之一。

AL患者大多数存在染色体易位、基因突变或其他遗传学异常。具有预后不良细胞或分子遗传学异常的患者，其处于G₀期的白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）是白血病难治和复发的根源。LSCs不仅具有干细胞特性，还能抵抗常规化疗药物，形成多重耐药的特性^[8]，而目前临床上应用的化疗方案常缺乏持久的疗效，这些药物可去除增殖快的白血病原始细胞，却无法有效地清除潜在的LSCs，因为它们多处于静止期，黏附并受保护于骨髓造血龛中，对常规化疗药物具有高度的耐药性，常不缓解并易形成白血病微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）而难以清除。

含细胞因子的预激化疗方案是克服白血病细胞黏附耐药的重要方法。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colon-stimulating factor，G-CSF）通过动员G0期耐药白血病细胞进入细胞周期等机制增加其化疗敏感度^[9]，达到提高其CR率和减少残留病的目的。目前的基础和临床研究结果多数证实其疗效确切，值得深入进行其机制及推广应用的临床研究。 1 关于造血微环境与白血病细胞耐药的研究

骨髓造血龛（niche）是调控造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和LSCs更新、增殖和分化的具有复杂结构和功能的造血微环境。骨髓造血龛由多种基质细胞成分、细胞因子及细胞外基质共同组成，根据其功能分为成骨细胞龛和血管龛两种，前者位于骨内膜表面，后者位于骨髓血窦的周围^[10]。成骨细胞和内皮细胞分别是两种龛的主要成分。成骨细胞区氧含量低，HSCs处于静止状态（低循环或G0期），而在血管区含氧量高，HSCs处于活跃的增殖状态^[11]。

尽管白血病细胞具有无限增殖的特性，但它的存活仍需依赖骨髓微环境^[12]。由于白血病细胞恶性增殖及细胞间的相互作用,骨髓龛也存在异常。同时异常的造血龛对LSCs具有促进增殖、维持生存、庇护药物杀伤等作用^[13]。成骨细胞龛在其中起着重要作用，它是通过黏附等机制保护LSCs逃避化疗药物及免疫因素引起的凋亡，这也是目前一些靶向LSCs治疗疗效不佳的重要原因。SDF-1/CXCR4轴在HSCs潴留在骨髓龛起着重要的作用^[14]。网状细胞^[15]、成骨细胞及巢蛋白阳性的骨髓MSCs^[16]表达SDF-1，而HSCs表达CXCR4。SDF-1可调节正常HSCs归巢、转移，支持它的存活^[17]。最近研究发现：Slit/Robo信号通路在HSPCs潴留在骨髓龛中也起着重要作用，并与CXCR4协同性地维持HSCs聚集在造血微环境中^[18]。

临床上白血病患者化疗失败、疾病复发的主要原因在于白血病细胞的耐药^[19]。研究显示耐药机制极其复杂，主要包括：Ｐ-糖蛋白（Ｐ-gp）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance related protein,MRP）^[20]等跨膜蛋白引起的药物泵入或泵出；FMS样酪氨酸激酶３（FMS-like tyrosine kinase3，FLT3）等基因的突变；p53基因的失活^[21]；拓扑异构酶改变药物靶点；PI3K/Akt等信号通路促进细胞存活等。而造血龛在白血病细胞对化疗的耐药方面起着重要的作用。研究发现，在白血病微小残留病和耐药形成过程中，白血病细胞通常并不是简单地黏附在骨髓基质细胞的表面，而是“潜伏”于由基质细胞形成的“微龛”中，通过利用“微龛”的理化和屏蔽作用，使其得以存活和实现其自身的增殖。而且储存于成骨龛中的白血病细胞多数处于G₀期，对各种放化疗手段均不敏感，因此进一步躲避了理化因素的杀伤，并最终形成化疗后原发耐药和MRD的“发源地”。因此，探索能够有效克服骨髓微环境黏附耐药、并将G₀期LSCs动员至细胞周期使其易于杀灭的措施，将可能有效地改善难治性白血病的治疗效果，值得深入研究。 2 G-CSF在AL化疗中的作用机制研究

G-CSF是一种促进造血细胞增殖的多肽因子。G-CSF通过与靶细胞表面特异性受体G-CSFR结合而发挥其生物学效应。G-CSF与G-CSFR结合可调节粒系细胞的增殖与分化，并增强成熟粒细胞的功能，提升机体的应激防御能力。G-CSFR在骨髓祖细胞、成熟的中性粒细胞、血小板、多种非血细胞等有表达。G-CSFR可以表达于ALL细胞^[22]。而且，G-CSF/G-CSFR系统可以参与到ALL细胞的增殖过程。

Kitagawa等^[23]应用白血病细胞株32Dcl3、U937、HL-60和Ba/F3研究AVG预激方案（低剂量Ara-C、依托泊苷VP-16和G-CSF）的效果和机制时发现：和不含G-CSF的方案相比，AVG能够进一步减低32Dcl3和U937细胞株的细胞数量和活力，促进细胞进入S期，进一步增加细胞凋亡，而对HL-60和Ba/F3细胞株没有影响。总的来说，不同的影响可能是由于不同的细胞株对G-CSF的反应不一样。G-CSF通过促进白血病细胞进入细胞周期，通过凋亡诱导机制增强Ara-C和VP-16的杀伤作用。Bai等^[24]发现G-CSF能够降低Ara-C对白血病细胞株和原代白血病细胞的LC50，除了和Ara-C有协同作用外，G-CSF能够促进白血病细胞的增殖，同时G-CSF能有效增加小剂量Ara-C对髓系白血病细胞的诱导及分化作用。白血病细胞表面高表达CXCR4是预后不良的标志^[25]。G-CSF可以抑制髓系白血病细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达从而抑制SDF-1/CXCR4的相互作用，最终促进白血病细胞从骨髓中释放。有研究表明G-CSF能够通过促进转录阻遏生长因子独立-1（transcriptional repressor growth factor independence-1，Gfi-1）的表达从而下调CXCR4的水平。Gfi-1能够结合CXCR4上游的DNA序列，抑制髓系细胞CXCR4的表达^[26]。因此G-CSF通过下调CXCR4的表达促进粒系细胞从骨髓中释放并且能够增强其他化疗药物对白血病细胞的杀伤作用。因此，目前认为预激治疗机制可能是在几乎所有的AML幼稚细胞均有G-CSFR的表达; 而G-CSF可能把骨髓中的白血病细胞“动员”到外周血中，从而增加循环血中的白血病细胞，所以在应用G-CSF后给予化疗，有利于细胞毒药物最大限度地杀灭AML细胞。同时，G-CSF能够诱导白血病细胞增生，G₀期白血病细胞进入细胞周期（S），从而提高化疗药物对AML细胞的杀伤作用。G-CSF的长期应用，还可诱导AML细胞的分化、诱导白血病细胞凋亡、抑制白血病细胞克隆的自我更新。因此，加用G-CSF的预激化疗方案可望提高AML患者的缓解率，延长其生存期。在诱导治疗和巩固治疗时应用G-CSF能够减少粒缺的持续时间、住院频率和抗生素的需要量^[27]。预激方案在临床上应用越来越广泛。 3 含G-CSF预激方案在难治/复发性AML治疗中的应用 3.1 低剂量预激方案

既往应用的小剂量化疗方案CR率低，持续时间短。Yamada等^[28]在1995年提出CAG预激方案，将低剂量阿糖胞苷（Ara-C）（10 mg/m²/12 h，d1~14）,阿克拉霉素（Acla）（10~14 mg/m²/day，d1~4）和 G-CSF（200 μg/m²/day）联合使用，治疗18例复发/难治性AML患者，1~2疗程后，取得了83%的CR率。有研究显示37例难治/复发性AML患者应用阿糖胞苷（10 mg/m²/12 h，d1~14），阿克拉霉素（5~7 mg/m²/day,d1~14），G-CSF（200 μg/m²/day,d1~14）方案预激处理，发现一个疗程后CR+部分缓解（PR）率为78.4 %（29/37），其中CR率为62.2 %（23/37），患者耐受性好^[29]。Mai等^[30]发现高三尖杉酯碱（HHT）能够促进白血病细胞滞留在S期，增强Ara-C对白血病的杀伤作用。一项对33例初治的老年患者（21个MDS和12个MDS-AML）的研究中发现所有患者都接受HAG方案化疗（Ara-C 25 mg，d1~14；HHT 1 mg，d1~14; G-CSF 300 μg提前一天应用到中性粒细胞恢复到2.0×109/L结束）。CR率为57.6%（19/33），PR率为9.1%（3/33），中位生存期15.0月，患者不良反应可以耐受。说明CHG方案安全有效^[31]。启用二线化疗药物，多药联合，在难治/复发性AML诱导缓解前加前期G-CSF诱导的方案也在临床试验中开展。研究发现，CAG方案联合VP-16（CEAG）治疗RR-AML患者CR率71.1%较CAG方案CR率50.9%高，而且两种方案对患者的不良反应并没有显著差异，患者5年总体生存率（OS）也没有差别^[32]。地西他滨（Decitabine）是一种去甲基药物，在骨髓增生异常综合征（MDS）取得了良好的进展^[33]。它在白血病中的应用也得到了重视，但地西他滨单药治疗AML有效率低于30%^[34]。研究结果显示，地西他滨联合预激方案的中位生存期为15月，明显高于传统治疗方案的2月，而且地西他滨治疗的安全性与支持治疗和小剂量阿糖胞苷治疗相比无明显差异^[35]。因此G-CSF联合地西他滨将更多的应用于预激治疗中。低剂量预激方案引起的化疗不良反应小，患者易耐受，将越来越多地应用于化疗中。 3.2 中剂量预激方案—FLAG

近年来，以氟达拉滨（Fludarabine，Flud）、阿糖胞苷及G-CSF组成的FLAG方案,常常用于难治/复发性白血病治疗或用于非清髓干细胞移植的预处理。Flud是一种核苷类似物，最初被用于治疗淋巴细胞增殖性疾病，它能够抑制处于G0期细胞DNA的修复及处于分裂期细胞DNA的合成，抑制细胞的增殖^[36]。但体内外研究证实，该药对髓系细胞同样具有细胞毒作用。Ara-C是治疗难治性和（或）复发性AML最有效的药物之一。它在细胞内需要转化成5’-三磷酸阿糖胞苷（Ara-CTP）才能发挥抗肿瘤的效应。Ara-C剂量越大,在细胞内形成的Ara-CTP越高,对白血病细胞杀伤作用也越大。使用Ara-C前4 h静脉滴注Flud，能够增加Ara-CTP的积聚，增加髓系白血病细胞内Ara-CTP的浓度，能在短时间内最大限度地杀伤白血病细胞。两者合用具有明显的协同作用，而且没有交叉耐药发生^[37]。联合G-CSF和中剂量Ara-C组成的FLAG方案，治疗难治和复发性AML的CR率可达30%~80%，一般可达55%左右。儿童复发AML的研究发现：应用FLAG方案后第一疗程CR率为56%，第二疗程CR率为72%，心脏毒性发生率为36%，患儿治疗效果好，耐受性好^[38]。对于复发/难治性AML，与CAG方案相比，采用FLAG方案治疗复发/难治性AML的CR率及总有效率更高，进一步证实对于原发难治AML及复发AML患者，FLAG方案疗效均优于CAG方案^[39]。尽管FLAG方案为有效的治疗方法，但由于该化疗方案骨髓抑制严重，且一般需要在层流病房进行治疗，因此费用较高，可能限制了该方案的推广。 3.3 含G-CSF的预处理方案

“清肿瘤性” 异体造血干细胞移植已在临床上实施。“它一方面是为移植的干细胞准备，另一方面是为了清除患者体内的白血病干细胞和免疫细胞等，提高移植的成功率。目前常用的预处理方案包括：FLAG/RIT方案、G-CSF预激方案和含大剂量阿糖胞苷的方案。其中，含G-CSF的预处理方案应用较多。Ooi等^[40]用G-CSF联合Ara-C或联合全身照射及Flu作为预处理方案，用无血缘关系的脐带血移植治疗成人AML，2年DFS为76%。在异基因外周血造血干细胞移植（allogeneic peripheral blood cell transplantation PBCT）中G-CSF的应用还能够减少急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）的发生，国外学者研究其机制时发现G-CSF作用于供者CD4+T细胞，上调细胞因子信号转导负调控蛋白3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3），减弱Th17细胞介导的aGVHD^[41]。因此在清肿瘤预处理方案中合理应用G-CSF不仅增加抗白血病效应，还可一定程度地分离GVHD和移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）效应，提高移植的安全性并减少复发率。 4 含G-CSF预激方案在难治/复发性ALL及急性混合表型白血病治疗中的应用

部分ALL患者G-CSFR可有表达，预示着G-CSF可能在ALL化疗中也有效。Xue等^[42]对6例难治/复发的ALL患者行CAG方案化疗，全部获得CR，患者耐受性较好。

Yavuz等^[43]对22例难治/复发的ALL患者行FLAG-IDA方案化疗，8例CR、2例PR，总有效率为52.7%。急性混合细胞白血病（biphenotypic acute leukemia，HAL）恶性程度及肿瘤负荷高，往往治疗困难、预后差。有研究者对5例难治性MAL患者行CAG方案化疗，4例患者获得CR，不良反应小，感染率低^[44]。说明G-CSF预激方案在难治/复发性ALL和MAL中也有着广泛的应用前景。 5 小结与展望

G-CSF越来越多地应用于化疗的预激治疗中，它不仅可以缩减粒缺的时间，而且可以增强化疗药物的杀伤作用。更多的化疗药物联合G-CSF将被研究。G-CSFR在AML和部分ALL患者中都有表达，含G-CSF的预激方案也将更多地应用于治疗复发难治ALL及急性混合表型白血病患者。另外，在骨髓增生异常综合征（MDS）和淋巴瘤中G-CSF的应用可能也有利于化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。然而，G-CSF对患者的远期影响尚不明确，能否促使白血病复发仍需大规模研究。随着对难治复发性AL研究的不断深入，各种治疗方案的不断改进以及各种新型细胞毒药物、分子靶向药物、免疫靶向药物的不断涌现，相信难治复发性AML的治疗疗效将有明显地提高，长期无病生存者也逐渐增多，临床的治愈率也逐渐增高。G-CSF也将更多地应用于难治复发性AL。因此，G-CSF对血液系统肿瘤患者和健康供者远期影响，有待于进一步研究。