肿瘤防治研究  2015, Vol. 42 Issue (5): 466-469
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

武林鑫,董彦鹏,孙亮,周亮,孙莉. 2015.
WU Linxin, DONG Yanpeng, SUN Liang, ZHOU Liang, SUN Li. 2015.
丁丙诺啡与吗啡联合用于大鼠骨癌痛治疗的疼痛行为学观察
Pain Behavior Observation of Buprenorphine Combined with Morphine on Bone Cancer
肿瘤防治研究, 2015, 42(05): 466-469
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42 (05): 466-469
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.05.009

文章历史

收稿日期:2014-04-10
修回日期:2014-07-29
丁丙诺啡与吗啡联合用于大鼠骨癌痛治疗的疼痛行为学观察
武林鑫, 董彦鹏, 孙亮, 周亮, 孙莉    
100021 北京,北京协和医学院中国医学科 学院肿瘤医院麻醉科
摘要目的 观察不同剂量的丁丙诺啡与吗啡联合应用于大鼠骨癌痛的疼痛行为学变化,为临床合理应用阿片类药物治疗癌痛提供参考。方法 选择成年雌性Wistar大鼠进行实验,应用Walker256细胞建立骨癌痛模型,将骨癌痛大鼠分为5组,每组8只,分别于每日7:00 am和19:00 pm进行皮下注射,连续7日。吗啡组(M组):吗啡10 mg/kg;吗啡+丁丙诺啡1组(MB1组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡20 μg/kg;吗啡+丁丙诺啡2组(MB2组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡40 μg/kg;吗啡+丁丙诺啡3组(MB3组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡60 μg/kg;假手术组(Sham组):皮下注射0.9%氯化钠溶液1 ml。全部大鼠于建模第15天开始,每日给药前30 min、给药后30 min进行疼痛行为学测定,包括甩尾实验、机械性痛觉敏感度测定、热痛觉敏感度测定。结果 给药7天内,机械痛阈和甩尾实验测定抗伤害痛阈结果显示,各MB组与M组给药后痛阈差异均无统计学意义;热痛阈结果显示:MB2组出现明显的热痛阈下降较M组晚(第6天vs.第5天)。结论 骨癌痛大鼠癌痛治疗时,丁丙诺啡与吗啡联合应用镇痛作用相似且可延缓吗啡的耐受发生。
关键词吗啡    丁丙诺啡    联合用药    耐受    骨癌痛    
Pain Behavior Observation of Buprenorphine Combined with Morphine on Bone Cancer
WU Linxin, DONG Yanpeng, SUN Liang, ZHOU Liang, SUN Li    
Department of Anesthesiology, Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical Colledge, Beijing 100021, China
AbstractObjective To investigate the therapeutic effects of different doses of buprenorphine combined with morphine on bone cancer pain in a rat model. Methods Female adult Wistar rats were selected for this experiment. After Walker256 rat breast cancer cells were subcutaneously injected into the left tibia of the rats to induce bone cancer pain, the model rats were divided into 5 groups (n=8 for each): M (mophine 10 mg/kg), MB1(morphine 10 mg/kg+ buprenorphine 20 μg/kg), MB2 (morphine 10 mg/kg+ buprenorphine 40 μg/kg), MB3 (morphine 10 mg/kg+ buprenorphine 60 μg/kg) and Sham (isotonic saline 1 ml). Morphine and/or buprenorphine were subcutaneously given twice a day (at 7:00 am and 7:00 pm, respectively) for 7 consecutive days. From day 15, all rats underwent behavioral pain tests including tail flick test, mechanical pain sensitivity test and thermal pain sensitivity test 30 min before and after drug adminstration at 7:30 am. Results Antinociceptive and mechanical pain threshold showed no significant difference between MB groups and M group. The presence of significant decrease in thermal pain threshold in MB2 group was later than that in M group (6th day vs. 5th day). Conclusion In the treatment for cancer pain in rats, the combination of morphine and buprenorphine has similar antinociceptive effect to morphine, moreover, it may delay morphine tolerance.
Key words: Morphine    Buprenorphine    Drug combination    Tolerance    Bone cancer pain    
0 引言

癌性疼痛是癌症患者的常见症状,晚期癌症患者中60%~90%以上患者具有疼痛症状[1]。目前药物治疗是癌痛治疗的首选方法,可使70%~90%癌痛患者得到不同程度缓解,阿片类药物是治疗中重度癌痛的最主要药物[2]

临床上,联合或交替应用不同镇痛药物进行癌痛治疗日益受到临床医生与研究人员的关注。近年来有研究结果表明,吗啡与阿片受体激动剂交替应用或与小剂量阿片受体拮抗剂联合应用等可获得良好的镇痛效应,并减少耐受等不良反应的发生[3, 4]。而吗啡与阿片受体激动剂-拮抗剂联合应用在临床上较为常见,但其临床效果尚无定论,理论上二者联合应用可能减弱吗啡的作用,但有研究表明,癌痛治疗中联合应用丁丙诺啡透皮贴剂可产生良好的镇痛效果并明显减轻阿片药物的依赖症状[5]

阿片受体激动剂-拮抗剂包括喷他佐辛和丁丙诺啡等,是临床麻醉与疼痛治疗中常用的一类阿片药物,丁丙诺啡作为阿片受体激动剂-拮抗剂的代表药物,广泛应用于临床[6]。本研究拟将丁丙诺啡联合吗啡应用于骨癌痛大鼠,观察其镇痛效果以及药物耐受发生的情况,为临床合理应用阿片类药物治疗癌痛提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 动物

动物实验已通过本院伦理委员会的审批,选择体质量160~200 g雌性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用于该实验。所有大鼠均严格按照国家部属实验动物管理委员会制定的实验动物环境条件标准进行饲养。实验开始前每天将大鼠称重一次,连续3天,以减轻或排除因捉拿而引起的应激反应;并对大鼠进行痛阈筛选,痛反应时间超过平均值±3倍标准差的大鼠剔除。根据预实验的结果,大鼠骨癌痛模型建立成功率为90%,本研究如后所述需骨癌痛大鼠40只,因此共需要大鼠45只。

1.2 细胞系

将0.5 ml的Walker256大鼠乳腺癌细胞(2×107/ml)注入Wistar大鼠腹腔中培养一周,一周后收集腹水3 ml,用0.9%的氯化钠溶液将C6稀释至2×107/ml细胞悬液,以供注射。

1.3 大鼠胫骨癌痛模型制备

骨癌痛组大鼠苯巴比妥麻醉(65 mg/kg)后仰卧捆绑,在左侧胫骨下1/3处做一小切口,切开皮肤,分离肌肉,暴露胫骨下1/3前内侧,使用10 ml注射器针头于骨膜处穿刺打孔,采用10 μl注射器进入骨髓腔1 cm,注射10 μl预先制备的Walker256细胞(2×105),注射后在骨髓腔内停留2 min,然后拔出注射器以骨蜡封闭针孔,清洗、缝合伤口,将大鼠送回饲养笼。

1.4 对模型进行评估 1.4.1 观察防御时间(Behavior Test of Nociception)

术后第1、3、5、7、9、11、13、15天,将大鼠放在实验台上自由步行2 min,记录后腿抬起的时间,正常抬起时间为0~2 s,若增加至8~16 s,则造模成功可用于实验。

1.4.2 影像学检查

为观察肿瘤细胞生长和骨质结构破坏程度,在术后15天对大鼠左侧胫骨进行了X线检测,观察骨质破坏情况。

1.4.3 组织学检查

为证明大鼠胫骨癌痛模型制作成功,在测定疼痛行为学后,处死大鼠,取左后肢行石蜡包埋、切片、HE染色,镜下观察肿瘤细胞生长和骨结构的破坏情况。

1.5 实验分组与给药方案

于大鼠骨癌痛模型建立后第15天,选取造模成功大鼠40只,每组8只,随机分为5组,连续7天,每日皮下注射2次,时间为7:30 am、7:30 pm,药物使用剂量根据预实验结果予以调整,分为:吗啡组(M组):大鼠皮下注射吗啡10 mg/kg;吗啡+丁丙诺啡1组(MB1组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡20 μg/kg;吗啡+丁丙诺啡2组(MB2组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡40 μg/kg;吗啡+丁丙诺啡3组(MB3组):吗啡10 mg/kg+丁丙诺啡60 μg/kg;假手术组(Sham组):皮下注射0.9%的氯化钠溶液1 ml。

1.6 疼痛行为学测定

全部大鼠于第15天起,每日7:30 am给药前30 min以及7:30 pm给药后30 min进行疼痛行为学测定,包括甩尾实验、机械性痛觉敏感度测定、热痛觉敏感度测定,由对实验分组未知的实验人员实施。

1.6.1 抗伤害阈值测定(Antinociceptive test)

甩尾实验利用盒子固定实验大鼠,测定其尾巴对热水刺激的甩尾反应,按基础甩尾时间为2~3 s,设定水浴箱温度,约为(52±0.5)℃,大鼠尾部置入水浴箱的长度约为3 cm,切断时间设定为10 s。

1.6.2 疼痛敏感度测定

为降低干扰,提前3天每日将大鼠放入底部为金筛网(筛孔为1 cm2)的有机玻璃箱(22 cm × 12 cm × 22 cm)中1 h进行适应。

(1)机械痛阈测定 待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min 后,采用1~60 g刺激力度不同的冯弗雷(von Frey)纤维分别垂直刺激大鼠左后肢足底中部,每次持续时间≤4 s,不同纤维的刺激间隔时间最少为15 min,为避免组织损伤,纤维最大刺激力度60 g。采用序贯法进行测定,首先使用最细的纤维,若出现未缩足的阴性反应,则逐渐增加压力,直到出现缩足的阳性反应,然后采用小一级的压力,若出现阴性反应,则上一级的压力视为机械痛阈,反复执行5次,每次至少间隔10 min,取各次痛阈的平均值。

(2)热痛阈测定 采用热辐射刺激仪测定热痛觉阈值:将大鼠置于有机玻璃箱中,使用辐射仪照射大鼠左足底对应的玻璃板部位,使空白对照组的缩足时间控制在14~16 s,选取该热辐射强度为标准强度,记录照射开始至大鼠出现缩足的时间(缩足潜伏期),观察点为大鼠缩足并伴有回头或添足,截止时间为30 s 。每只动物测定3 次,取其平均值,每次测定间隔不少于10 min。

给药第8天晨,将各组大鼠放入CO2麻醉箱中处死大鼠,左胫骨肿瘤取材放入福尔马林中浸泡,行病理检验。

1.7 统计学方法

用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据采用均数±标准差表示,防御时间、热痛阈、机械痛阈和甩尾实验组内比较采用2-way ANOVA,组间比较采用Bonferroni test,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

骨癌痛模型建立后第15天所有骨癌痛大鼠评估结果显示,防御时间8~16 s的大鼠42只,同时X线检测可见左胫骨骨质破坏,造模成功率93%,选取40只随机分为5组进行实验。

给药7天内,机械痛阈和甩尾实验测定抗伤害痛阈结果显示,各MB组与M组给药后痛阈差异均无统计学意义,见表 1~2。

表 1 各组骨癌痛大鼠抗伤害阈值比较 (s,n=5,x±s) Table 1 Comparison of antinociceptive effect among groups (s,n=5,x±s)
表 2 各组骨癌痛大鼠机械痛阈比较(s,n=5,x±s) Table 2 Comparison of mechanical withdrawal threshold among groups(s,n=5,x±s)

热痛阈结果见表 3:M组第1~4天给药后热痛阈较Sham组明显升高,第5天开始给药后热痛阈与Sham组比较差异无统计学意义(P=0.09);而MB2组7天内给药后热痛阈至第6天出现,与Sham组比较差异无统计学意义(P=0.516),MB2组热痛阈下降较M组晚,见图 1;MB1组1~3天和MB3组2~3天给药后热痛阈虽高于Sham组,但明显低于M组,且第3天开始,两组给药后热痛阈与Sham组比较差异无统计学意义(MB1 vs. Sham,P=0.074;MB3 vs. Sham,P=0.101)。

表 3 各组骨癌痛大鼠热痛阈比较(s,n=5,x±s) Table 3 Comparison of thermal withdrawal latency among groups(s,n=5,x±s)
图 1 各组骨癌疼痛大鼠热痛阈的比较 Figure 1 Comparison of thermal withdrawal latency among groups
3 讨论

骨癌痛是癌痛中最常见的疼痛类型[7],多见于原发肿瘤的骨转移,如肺癌、乳腺癌或前列腺癌等[8],应用阿片类药物经常难以控制疼痛症状[9]。骨癌痛大鼠模型用于癌痛治疗研究可以很好地模拟骨癌痛患者的一些临床表现,例如骨质破坏和神经压迫等[10],本研究结果表明,骨癌痛大鼠组从模型建立第5天开始防御时间较对照组明显延长,且X线检查显示明显的骨质破坏,证明成功建立了大鼠的骨癌痛模型。

丁丙诺啡为μ阿片受体的部分激动剂,对于阿片受体有激动-拮抗性。关于丁丙诺啡与吗啡联合应用的效果目前尚存在争议,Aurilio等[11]经临床观察发现丁丙诺啡与吗啡合用时可发挥镇痛的协同效应;Roux等[12]研究也发现,丁丙诺啡可减轻羟考酮引起的戒断症状和滥用倾向。而小鼠实验发现,二者联合应用可降低吗啡的抗伤害效应,认为可能机制为竞争性的拮抗了吗啡对μ受体的作用[13]。本研究中,丁丙诺啡与吗啡联合应用较吗啡单独应用的机械痛阈和抗伤害痛阈差异均无统计学意义,表明对于骨癌痛大鼠,联合用药与单独应用吗啡镇痛效果相似,丁丙诺啡并未影响吗啡的镇痛效应。

长期应用吗啡可产生耐受,其机制较为复杂。目前为止,吗啡耐受中各阿片受体的作用尚无一致结论,吗啡主要通过作用于μ阿片受体而发挥作用,μ受体上调、下调、脱敏感和内在化均可能与吗啡耐受有关[14, 15, 16, 17],κ和δ受体也在吗啡耐受中起着重要的作用。本研究中,单用吗啡第5天时则出现了热痛阈的明显下降,与对照组差异无统计学意义,表明出现了明显的药理学作用下降,即发生了耐受,而吗啡联合40 μg/kg的丁丙诺啡,给药后热痛阈至给药第5天仍明显高于对照组,表明40 μg/kg的丁丙诺啡与吗啡联合应用,可延缓吗啡耐受的形成,但具体机制尚需进一步研究,包括二者联合应用时对于μ受体的功能以及对κ和δ受体的影响。这也是本实验的不足之处,未对中枢及外周的阿片受体水平及功能等进行更深入的实验研究,也是今后研究的方向。

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武林鑫, 董彦鹏, 孙亮, 周亮, 孙莉