口腔癌作为头颈部较为常见的一类恶性肿 瘤，以鳞状细胞癌最为多见，传统的综合治疗方 法难以提高口腔癌的5年生存率，较高的局部复发 率是口腔颌面外科医师必须面对的棘手问题。近 年来，国内外研究表明，机体免疫系统监视着恶 性肿瘤的发生和转移，虽然免疫功能低下不直接 导致恶性肿瘤发生，但却影响着其发展、转归及 预后等状况。因此，应用免疫治疗来辅助并巩固 口腔癌的治疗成为我们关注的焦点。

白介素17（IL-17）作为辅助性T细胞17（Th17） 分泌的一类特征性细胞因子及主要效应因子，具有 强大的促炎性反应能力^{[1, 2]}，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节 性T细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg）是一种免疫抑制 性细胞，通过高表达CD4、CD25及Foxp3分子来发 挥强烈的抑制功能，导致肿瘤免疫逃逸的发生^[3]。 Foxp3基因是目前公认的Treg细胞特异性的标记， 在Treg细胞的发育及调控中起着关键作用^{[4, 5]}。

本研究拟通过检测口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者外周血及癌组织中 IL-17和Foxp3的表达，探讨IL-17和Foxp3在口腔鳞 癌发生发展中的作用，为其应用于临床免疫治疗 及评估预后提供依据。 1 资料与方法 1.1 临床资料

随机选取2011年9月—2012年10月河北医科大 学第四医院口腔科40例原发初诊经病理证实的口 腔鳞癌患者，发病部位包括舌、颊、腭、牙龈、 口底等，年龄40~72岁，中位年龄60岁，男女比例 为1.35∶1，按照国际抗癌协会（UICC）2002年公 布的TNM分期标准分为：Ⅰ期7例，Ⅱ期19例，Ⅲ 期6例，Ⅳ期8例。选取20例良性肿瘤患者的瘤旁 经病理证实的正常口腔黏膜作组织对照。研究对 象分为3组，A组26例（Ⅰ+Ⅱ期）、B组14例（Ⅲ +Ⅳ）、C组20例（健康者），各组对象均为非急 性感染期并排除全身系统性疾病，实验已取得患 者及家属知情同意。 1.2 主要试剂及仪器

FITC-鼠抗人CD4单抗、PE-鼠抗人IL-17单 抗、CD4-FITC/CD8-PE双标抗体、CD3-FITC/ CD56-PE双标抗体（美国Beckman Coulter公司）， Cy5-鼠抗人Foxp3单抗（美国eBioscience公司）， 兔抗人IL-17多克隆抗体、兔抗人Foxp3多克隆抗体 （武汉博士德生物工程有限公司），SP免疫组织 化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金 桥生物科技有限公司），流式细胞仪Epics-XL Ⅱ 型（美国Beckman Coulter公司）。 1.3 实验方法 1.3.1 标本采集及处理

清晨空腹状态下，抽取各组对象外周静脉血 3 ml，抗凝管收集血样，用于流式细胞术检测。 手术切除新鲜标本均用10%中性福尔马林液固 定，常规脱水、石蜡包埋，每例连续切片4张， 切片厚度4 μm，置于经预处理的载玻片上，于 68℃培养箱中放置8 h以上，备免疫组织化学IL-17 和Foxp3染色用。 1.3.2 外周血中IL-17、Foxp3的测定

取各组肝素抗凝外周静脉血100 μl，加入10 μl FITC标记的CD4单抗，室温、避光标记30 min， 加入破膜剂（0.1% triton-x100）1 ml作用1 min， 加入PBS洗涤细胞1次，分别加入10 μl PE标记的鼠 抗人IL-17、Foxp3抗体，同时设同型对照管，轻轻 振荡混匀后，室温、避光标记30 min，加入红细胞 裂解液裂解红细胞。流式细胞仪测定，CD4⁺T细胞 设门，分析门中IL-17阳性细胞比例，应用Expo 32 ADC软件进行免疫荧光数据分析。 1.3.3 T淋巴细胞表面标志的测定

取肝素抗凝外周静脉血各100 μl，分别加入 CD4-FITC/CD8-PE及CD3-FITC/CD56-PE双标抗体 各10 μl，在室温下避光放置30 min，加入红细胞裂 解液裂解红细胞，上流式细胞仪进行检测，应用 Expo 32 ADC软件进行免疫荧光数据分析。 1.3.4 组织中IL-17、Foxp3的测定

采用免疫组 织化学SP(streptavidill-perosidase)法分别观察各 组组织中IL-17与Foxp3的表达。IL-17的阳性染色 为细胞质或细胞膜内有棕黄色颗粒，Foxp3的阳性 染色为细胞核内有棕黄色颗粒，以PBS代替一抗 的正常口腔黏膜上皮组织免疫组织化学染色结果 作阴性对照，以试剂盒自带阳性片免疫组织化学 染色结果作阳性对照。每张切片随机选取5个高倍 视野，读取100个细胞中的阳性细胞数，取其平均值。先根据阳性细胞所占的百分数计分：<5%计 为0分；5%~25%计为1分；>25%~50%计为2分； >50%~75%计为3分；>75%计为4分。再根据阳性 细胞染色强度计分：无着色计为0分；淡黄色计为1 分；棕黄色计为2分；棕褐色计为3分。两者积分相 加所得的总分按照：0~1分计为（-）；2~3分计为 （+）；4~5分计为（++）；6~7分计为（+++）^[6]。 阴性（-）和弱阳性（+）归为阴性（-），中度阳 性（++）和强阳性（+++）归为阳性（+）。 1.4 统计学方法

实验数据均采用均数±标准差（x ±s）来表 示，应用SPSS 13.0统计软件进行分析，采用t检 验、χ²检验和Pearson相关性分析等方法进行相关检 验，若资料不符合正态分布或方差不齐，则应用 非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 外周血中IL-17及Foxp3的测定

A和B组外周血中CD4⁺IL-17⁺、CD4⁺Foxp3⁺ 细胞的比例分别为（10.50±4.52）%、（7.02± 4.54）%，均显著高于C组（1.45±0.19）%、 （2.73±0.60)%（P<0.01），并且二者的表达 水平呈正相关（r=0.772，P<0.05）。B组患 者CD4⁺IL-17⁺、CD4⁺Foxp3⁺细胞的比例分别 为（14.25±4.17）%、（11.16±3.64）%，显 著高于A组（8.49±3.27）%、（4.79±3.24）% （P<0.05）。IL-17、Foxp3的表达与性别、年龄及 吸烟与否无相关性（P>0.05），见表 1、图 1~2。

表 1 不同临床特征的口腔鳞癌患者外周血中IL-17和Foxp3的表达 Table 1 Comparison of IL-17 and Foxp3 expression in peripheral blood specimen from OSCC patients by different clinical classification

表选项

A: IL17-PE in the peripheral blood of patients with oral squamous cell carcinoma(OSCC); B: IL17-PE in the peripheral blood of normal subjects; C: Isotype control; D: Foxp3-PE of in the peripheral blood of OSCC patients; E: Foxp3-PE in the peripheral blood of normal subjects 图 1 流式细胞术检测外周血中CD4+IL-17+T细胞和CD4+Foxp3+T细胞比例 Figure 1 The proportion of CD4+IL-17+T and CD4+Foxp3+T cells in peripheral blood determined by flow cytometry(FCM)

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图 2 外周血中CD4+IL-17+T细胞和CD4+Foxp3+T细胞表达水平的相关性 Figure 2 Correlation of CD4+IL-17+T and CD4+Foxp3+T cell expression in peripheral blood specimen

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与对照组相比，实验组外周血中CD3⁺和 CD4⁺细胞的百分率、CD4⁺/CD8⁺的比值降低，CD8⁺细胞的百分率升高，差异均有统计学意义 （P<0.05）；CD56⁺细胞的表达较对照组高，但差 异无统计学意义（P>0.05），见表 2、图 3。

表 2 流式细胞术检测各亚类T细胞在不同组别中的表达 (x ±s) Table 2 Expression of T-lymphocyte subsets in different groups detected by FCM (x ±s)

表选项

图 3 流式细胞术检测外周血中CD3+、 CD4+、 CD8+和CD56+ T细胞比例 Figure 3 The proportion of CD3+,CD4+,CD8+ and CD56+ T cells in peripheral blood determined by FCM

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IL-17、Foxp3在实验组中阳性率分别为60.0% （24/40）、67.5%（27/40），均明显高于对照组 [10.0%（2/20）、0%（0/20）]，差异具有统计学 意义 （P<0.01）。IL-17在Ⅲ+Ⅳ期口腔癌癌组织 中的阳性表达率为85.7%（12/14），显著高于Ⅰ +Ⅱ期的阳性表达率46.2%（12/26）（P<0.05）； Foxp3在Ⅲ+Ⅳ期癌组织中阳性表达率为78.6% （11/14），显著高于Ⅰ+Ⅱ期的阳性表达率42.3% （11/26）（P<0.05）。癌组织中IL-17与Foxp3表 达水平呈正相关性（r=0.386，P<0.05）。性别、 年龄及吸烟与否与癌组织中IL-17、Foxp3的表达未 见明显相关性（P>0.05），见表 3、图 4 。

表 3 不同临床特征下口腔癌组织中IL-17和Foxp3的表达 Table 3 Comparison of IL-17 and Foxp3 expression in oral cancer tissues by different clinical classification

表选项

A: OSCC tissues(IL-17-); B: OSCC tissues (IL-17+); C: normal group (IL-17); D: OSCC tissues(Foxp3-); E: OSCC tissues (Foxp3+); F: normal group (Foxp3) 图 4 口腔鳞癌组织和正常组织中IL-17和Foxp3的表达 (HE ×200) Figure 4 The expression of IL-17 and Foxp3 in OSCC and normal tissues (HE ×200)

图选项

口腔鳞状细胞癌简称口腔鳞癌，是最常见的 口腔恶性肿瘤，5年生存率只有40%～50%，因发 病部位位于口腔颌面部，无论是在发病过程中， 还是应用传统方法进行治疗，颜面部的畸形都严 重影响了患者的生活质量。如何早期发现肿瘤并 进行针对性的个体预防及治疗，成为现代医疗发 展的方向。随着近代分子细胞生物学的发展，人 们发现免疫系统与肿瘤的发生、发展及转归密切 相关。Schreiber等^[6]提出，在肿瘤发展过程中， 存在免疫监视、免疫相持和免疫逃逸三个不同阶 段；其中免疫监视主要指免疫系统杀伤破坏肿瘤 细胞或抑制肿瘤细胞增殖的能力，而一旦肿瘤细 胞适应了生存环境，开始具有逃避免疫系统识别 和攻击能力的时候，肿瘤细胞就会大量繁殖。因 此，免疫监视的逃逸成为癌症的主要特征之一^[7]。

CD4⁺T细胞通过不同细胞因子的释放，在肿瘤 免疫监视中起着重要调节作用。根据最新研究， CD4⁺T细胞分为4类：Th1、Th2、Treg及Th17。 IL-17和Foxp3作为Th17和Treg细胞的特征性因子， 在肿瘤中的作用已经成为研究热点，但IL-17在肿 瘤中的功能效应目前存在争议。本实验发现IL-17 在口腔鳞癌患者外周血及癌组织中的表达均明显高于健康者，并且随着肿瘤分期的进展，IL-17的 比例逐渐增加，提示IL-17在口腔癌的发展中起到 促进作用。实验中部分早期口腔癌患者外周血中 IL-17的表达水平低于健康者，分析其原因在于早 期患者外周血中的Th17细胞能被特异性地招募至 口腔癌组织中，Th17在CD4⁺细胞中的比率降低， 导致外周血中IL-17减少；而晚期癌症患者中肿瘤 血管浸润和转移现象多见，导致被招募的Th17细 胞又循环至外周血中，从而出现晚期患者外周血 中IL-17细胞比率比健康者和早期癌症患者高的现 象。这种淋巴细胞循环方式导致了不同临床分期 患者的外周血中IL-17所占比例有所不同。

为了解口腔癌患者机体免疫状态和IL-17的关 系，本实验还进行了外周血中CD3、CD4、CD8、 CD56的测定，发现随着肿瘤的进展，机体内以T 细胞为主的细胞免疫功能进行性降低，IL-17水平 逐渐增高。据此，我们推测IL-17与其他细胞因子 类似，在肿瘤中的作用具有多效性，其促进或抑 制肿瘤的作用很大程度上依赖于肿瘤免疫原性； 随着机体免疫功能愈加受到抑制，肿瘤微环境中 浸润的IL-17表面抗原发生改变，进而更多的发 挥其促瘤作用，具体机制需要进一步分子实验证 实。本实验结果提示，IL-17与口腔鳞癌的发生、 发展密切相关，其表达水平对于评估预后具有很 大的临床价值。

Foxp3作为CD4⁺CD25⁺调节性T细胞发育的 一个关键转录因子，不仅是Treg细胞（主要指 CD4⁺CD25⁺Treg）发育、分化及发挥免疫抑制功能 的关键性因素，它自身在肿瘤微环境中对肿瘤免 疫逃逸过程还起着非常重要的作用，并且这种作 用是通过非Treg依赖途径实现的^{[3, 8, 9, 10]}。本实验研究 结果显示Foxp3在口腔鳞癌患者的外周血及癌组织 中的表达均明显高于正常组，且Foxp3的表达情况 与患者TNM分期存在相关性，提示Foxp3与口腔癌 的发生密切相关，在癌的进展过程中，Foxp3抑制 肿瘤免疫反应的作用逐渐增强，导致肿瘤细胞的 免疫逃逸，它的增殖促进了肿瘤的发展。从本实 验的结果看，无论是Foxp3本身高表达发挥作用， 参与非Treg途径抑制肿瘤免疫，还是Foxp3的表达 间接代表了Foxp3⁺Treg细胞浸润状态，Foxp3对于 机体免疫系统来说都是一个重要的负调节因素。 通过分子生物手段，控制肿瘤微环境中的Foxp3和 Foxp3⁺Treg细胞数量并调节其生物学功能，将提高 肿瘤的免疫治疗效果。

在大多数免疫相关疾病 ^{[11, 12]} 如类风湿性关节 炎（RA）、哮喘、系统性红斑狼疮（SLA）等 中，Th17与Treg起着截然不同的作用：Th17细胞 主要通过分泌IL-17来募集中性粒细胞，从而介导 促炎性反应；Treg细胞则主要在保持机体的自身耐 受性中发挥决定性的免疫抑制作用。但在口腔癌 的发生发展中，我们发现外周血及癌组织中IL-17 和Foxp3表达水平呈正相关，而并非“此消彼长”的 关系。这与Larmonier等^[13]对胃癌的研究及王维维 等^[14]对肝癌的研究结果一致。提示在肿瘤局部微 环境中IL-17和Foxp3可能存在相互调节作用，共同 促进肿瘤的发生、发展。

但是，IL-17和Foxp3在肿瘤微环境中是如何发 挥协同作用的？是否具有共同的分子信号转导通 路？有待于进一步研究。深入了解IL-17与Foxp3之 间协同作用的机制，将有利于口腔癌的临床早期 诊断和治疗，更好的完善临床免疫治疗方案。