膀胱癌是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第1位，恶性肿瘤发病率第8位，其发病率呈上升趋势。新诊断的膀胱癌患者中约5%的患者已发生远处转移^[1]。膀胱癌转移是一个复杂、多步骤的过程。首先是膀胱癌细胞黏附性降低，癌细胞开始脱离原位运动，接着突破膀胱基底膜，在黏膜层存活，侵犯肌层，伴随着浸润，肿瘤会诱导血管形成，进一步促进转移。膀胱癌细胞侵入血管，在血管中存活，随血流到达远处转移器官或组织，移行出血管在器官实质种植。对上述过程有影响的因素，均可能对膀胱癌转移发挥影响作用。

目前对于浸润性膀胱癌所采用的标准治疗：根治性手术配合化疗、放疗，效果不甚理想。膀胱癌患者一旦发生膀胱外转移，其5年生存率仅为6%^[2]，治疗效果及预后很差。因此，很有必要探索更有效的治疗手段。近年来贝伐单抗、赫赛汀等多种靶向药物应用于膀胱癌的治疗，相对传统的化疗，治疗效果显著并且无明显不良反应，由此我们看到了靶向治疗应用的前景^[3]。随着对膀胱癌分子生物学机制研究的深入，发现了RhoGDI2、erbB1/EGFR酪氨酸受体、钙结合蛋白S100A4、p53和MTSS1等基因与膀胱癌进展转移密切相关，可针对这些基因开发相对应的靶向治疗药物^[4,5]。本文详细介绍RhoGDI2基因及其对膀胱癌转移的作用，希望能为膀胱癌的治疗提供新的思路。 1 RhoGDI2概述

RhoGDI2基因位于染色体12p12.3位点，含4个内含子，编码由201个氨基酸组成的蛋白质。在基因表达、细胞周期、分化、迁移、衰老、凋亡和囊泡运输中起着重要作用^[6]。 1.1 不同转移潜能膀胱癌细胞中RhoGDI2表达差异

Gildea等^[6]比较了两种不同转移潜能的膀胱癌细胞：T24和T24T，T24细胞的致瘤性及转移性能均较弱，而T24T细胞的致瘤性高且有高度转移性能。通过核型分析，比较基因组杂交，位置表达等方面来比较T24和T24T细胞系的基因差异，发现在T24T细胞表达下调排名前30位的基因集中下调最多的基因是RhoGDI2，降低了约6.8倍^[6]。因此，认为RhoGDI2基因可能与膀胱癌转移密切相关，RhoGDI2基因表达的下降导致了膀胱T24T细胞的转移。1.2 RhoGDI2表达与膀胱癌转移及预后的关系

为了验证RhoGDI2基因与膀胱癌转移的相关性，Gildea等^[7]评估105例膀胱癌临床病理标本中RhoGDI2的表达情况，发现RhoGDI2表达水平与肿瘤的分级和分期呈负相关，即在高级别、高分期肿瘤中的表达降低，并且RhoGDI 2是唯一一个与肿瘤分级和分期对应的基因。为了证实RhoGDI2基因是膀胱癌转移抑制基因，Seraj等将RhoGDI2基因转染到T24T细胞，对照组为空载质粒。实验组T24T-RhoGDI2皮下注射后肿瘤未向深层浸润，均局限在膀胱基底膜，从尾静脉注射进入小鼠后，实验组8只小鼠中有4只肺部形成肿瘤，平均结节数为5个。空载对照组均发现有深层浸润，全部7只小鼠发现肺部转移，平均结节数32个^[8]。

Theodorescu等^[9]探讨了膀胱癌中RhoGDI2蛋白表达水平与疾病预后的关系，采用组织芯片技术检测不同膀胱癌细胞株和其他人体器官RhoGDI2蛋白表达情况，发现正常组织的RhoGDI2蛋白高表达，RhoGDI2蛋白的表达与膀胱癌细胞株的侵袭性和转移性呈负相关。单因素生存分析表明，RhoGDI2高表达膀胱癌患者的无进展生存期及总生存时间较低表达者延长。RhoGDI2表达缺失或低表达患者的生存时间缩短，死亡率上升。RhoGDI2的表达被认为是某些特定肿瘤独立的死亡预测因素，蛋白水平具有独立预测生存率的能力^[7]。2 RhoGDI2在肿瘤转移中的分子机制 2.1 RhoGTP酶在肿瘤进展中的作用

RhoGDI2作为RhoGTP酶的GDP解离抑制因子RhoGDIs成员之一，主要通过调节RhoGTP酶活性发挥作用。RhoGTP酶家族成员主要包括Rho（RhoA、RhoB和RhoC），Rac（Rac1、Rac2、Rac3和RhoG），Cdc42（Cdc42Hs、G25K和TC10），Rnd（RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6和Rnd2/Rho7），RhoD（RhoD和Rif），RhoH/TTFWrch（Wrch-1和Wrch-2）和RhoBTB（RhoBTB1和RhoBTB2）等，其中以Rho、Rac、Cdc42的研究较为集中^[10]。对RhoGTP酶研究最多的是其对细胞骨架肌动蛋白的调节，Rac1调节伪足和细胞皱褶的形成，RhoA调节黏附斑的组成及肌球蛋白肌丝收缩，Cdc42调节伪足形成，Rac1和Cdc42激活p21激酶（Paks）。RhoGTP酶也调节细胞外基质ECM和微管运动^[10]。

RhoGTP酶可通过抗血管形成而抑制肿瘤浸润转移。用血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）处理的内皮细胞中，RhoA、Cdc42和Rac1迅速被激活，暗示Rho蛋白可能是血管内皮生长因子受体（vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR）直接的下游分子之一，VEGF通过VEGFR-2激活RhoGTP酶，VEGF激活受体后，与受体结合的c-Src磷酸化Vav2和GTP酶激活蛋白IQGAP1，进而激活RhoA、Cdc42和Rac1，通过Cdc42-PAK1-p38-HSP27或者HSP90-RhoAROCK-FAK引起细胞增殖及迁移，血管渗透性升高，抑制内皮细胞的屏障功能，促进血管基底膜降解，内皮细胞增殖移行以及毛细血管的形成^[11]。

RhoGTP酶也可通过细胞外基质途径抑制肿瘤浸润转移。具体的通路有：ECM-ILK-CDC42-肌动蛋白细胞骨架-细胞迁移，ECM-ILK-PIX-Rac-肌动蛋白细胞骨架-细胞迁移。RhoA、Cdc42和Rac1激活JNK和P38MAP激酶通路，Rac1和RhoA调节其他非肌动蛋白效应因子，如NF-κB ^[12]。

RhoGTP酶在多种肿瘤及肿瘤的多个阶段发挥作用。例如在直肠癌的进展中，从正常上皮到早期腺瘤阶段，存在Apc基因的突变。从早期腺瘤到晚期腺瘤再到癌变，又分别涉及原癌基因RAS、p53基因的突变。这些基因的突变通过Rho、Rac和Cdc42影响ROCK信号通路，对细胞的浸润、迁移、血管形成发挥重要作用。其中Ras信号通路分别为：Ras—Raf—Mek—MAPK—细胞增殖运动，Ras—P13K—Akt—细胞增殖运动，Ras—Rac1—板状伪足—细胞增殖运动，Ras—Rac1—Rho—ROCK1—肌球蛋白调节轻链（myosinlight-chain，MLC）—肌动蛋白压力纤维—细胞增殖运动，最后的效应为细胞增殖运动^[13]。除此之外，也有人认为RhoGTP酶是转录调节因子，能够调节SRF、NF-κB、STATs、CREB和其他涉及肿瘤生长的转录因子^[14]。

Rho有两个主要的效应因子，即Rho相关蛋白激酶（Rhoassociatedcoiled-coilformingkinase，ROCK）和果蝇哺乳同源酶（mammalianhomologofDrosophiladiaphanous，mDia）。ROCK是丝氨酸/苏氨酸激酶，可被磷酸化而激活各种基质。两种亚型ROCKⅠ和ROCKⅡ表达增高与膀胱癌转移正相关^[15]。mDia1属于成蛋白相关蛋白家族，RhomDia1可通过两条通路转导信号：一条为Rho激活mDia1，随后肌动蛋白肌丝重组，c-Src移至黏着斑，cas磷酸化及Rac活化，黏着斑转动，最后细胞迁移。另一途径是在mDia1作用下，Cdc42和APC聚集到细胞优势前沿，细胞极化而至细胞迁移^[16]。 2.2 RhoGDIs调节RhoGTP酶的方式

RhoGDIs有RhoGDI1、RhoGDI2、RhoGDI3几种类型。RhoGDI2的主要功能是作为RhoGTP酶的活性开关，调节RhoGTP酶活性状态Rho-GTP和非活性状态Rho- GDP之间的循环，其过程主要涉及3类分子：鸟嘌呤核苷酸交换因子（guaninenucleotideexchangefactors,GEFs），GTP酶激活蛋白（GTPase-activatingprotein，GAP）和GDIs。RhoGTP酶的活化过程如下：在细胞质中存在GDI时，形成RhoGTP酶-GDP-GDI，为牢固的非活性状态，如去除GDI时，转变为RhoGTP酶-GDP，仍为无活性状态直至RhoGTP酶-GDP迁移到细胞膜，在膜上的GEFs作用下转化为RhoGTP酶-GTP，转为活性状态，再与细胞质中的效应因子作用，活化下游的信号通路。RhoGTP酶-GTP会在GAP的作用下转变为RhoGTP酶-GDP无活性状态，形成循环。RhoGDI2对RhoGTP酶在细胞内的定位发挥积极的作用，主要通过空间限制，指导和接近效应因子^[8]。由于大多数RhoGDI2位于细胞质，也往往在细胞质中阻断分子信号^[10]。RhoGDI2在细胞质能与异戊二烯GDP结合的RhoGTP酶形成可溶性复合物，并在膜界面监控RhoGTP酶的传递和提取^[17]。RhoGTP酶被RhoGDI2释放时，它就能够插入到质膜的脂质双层，激活膜相关的GEFs，进而自身活化^[8]。可以看到，从RhoGDI2解离是RhoGTP酶能结合膜和被GEFs激活的先决条件。重新与RhoGDI2结合，可能与GTP水解有关，会导致RhoGTP酶重新回到细胞质，回到非活化状态。通过与RhoGDI2结合或解离调节RhoGTP酶的细胞质-膜循环，使它在调节RhoGTP酶活性和功能上起主要作用。2.3 RhoGDI2的作用与Rac1之间的关系

RhoGTP酶-RhoGDI2复合物的形成是动态调节而不是一成不变的。RhoGTP酶从RhoGDI2的解离有几种不同的机制：磷酸化，蛋白分解和磷脂化。RhoGDI2对RhoGTP酶的亲和力较低和影响力较弱，而RhoGDI2结合Rac1的亲和力最高^[18]。RhoGDI2特异结合Rac1，以肿瘤类型依赖的方式正/负向调节其活性，RhoGDI2通过调节Rac1的活性调节侵袭和转移能力。尽管RhoGDI2表现出较强的抑制转移的作用，但对于RhoGTP酶膜定位和功能方面的抑制较弱。然而，如果RhoGDI2发生点突变，其与GTP酶的亲和力不论是增加还是减少，转移抑制的作用均会消失，提示RhoGDI2转移抑制机制可能是由于其与Rac1的结合，促进其与特定的GEFs相互作用。另外发现转移抑制作用与Rac1的活性增加相关。研究表明，RhoGDI2通过RhoGTP酶抑制转移，是一个有别于抑制联合膜的机制^[19]。抑制RhoGDI2从Rac1释放，防止Rac1蛋白与RhoGDI2作用，从而抑制转移，这或许可作为提高肿瘤治疗有效率的策略。令人惊讶的是，将野生型RhoGDI2转染膀胱癌细胞，会导致Rac1的活性增强，但转移抑制功能仍然降低。应用RNA干扰技术沉默RhoGDI2会导致Rac1的激活，并从细胞质转移到质膜^[18]。Huang等^[20]表明RhoGDI2在H9c2心肌纤维细胞通过活化Rac1诱导细胞肥大生长和迁移。RhoGDI2过表达能增加Rac1的表达，从而导致膜相关Rac1水平的增加。这些结果表明RhoGDI2能通过调节Rac1的活性影响肿瘤细胞转移。Rac1在肿瘤进展和转移的过程中可起促进作用（在胃癌和心肌纤维细胞）和抑制作用（乳腺癌和膀胱癌）。这种差异并不奇怪，因为RacGTP酶在调节细胞生长，存活和迁移发挥双重作用，是刺激还是抑制信号通路取决于肿瘤的类型和（或）细胞微环境^[21]。因此，RhoGDI2在肿瘤转移的作用可能是或至少部分是依赖Rac1对GTP酶的双重功能。 3 RhoGDI2的磷酸化与膀胱癌转移的关系

RhoGDI2的磷酸化可引发一系列问题，非受体酪氨酸激酶Src磷酸化RhoGDI2在膀胱癌肿瘤发展中的作用如何？RhoGDI2磷酸化对膀胱癌的转移抑制作用会发生怎样的变化？又是通过什么途径发生这些变化的呢？3.1 RhoGDI2的磷酸化位点

最近新发现Src激酶作为RhoGDI2的一种结合分子，能磷酸化RhoGDI2的特定酪氨酸残基，从而影响其转移抑制功能。蛋白质组学实验表明Src在膀胱移行细胞癌与RhoGDI2的结合存在4个潜在的Src磷酸化位点，即Tyr-24、Tyr-125、Tyr-153和Tyr-172^[22]。Src在胞外和胞质中，通过酪氨酸153位点磷酸化RhoGDI2。当RhoGDI2的磷酸化点突变，即RhoGDI2-Y153E（153位点由Y转为E），表现出与Rac1的结合减弱，降低了RhoGDI2提取细胞膜Rac1的能力。若RhoGDI2-Y153F点突变不能被磷酸化，则表现出增强与Rac1结合，增加取得从膜上提取Rac1蛋白的能力。并且，Src对RhoGDI2酪氨酸153位点的磷酸化能增加RhoGDI2对膜的定位。当RhoGDI2-Y153E点突变介导到UMUC3膀胱癌细胞，与对照的WT-RhoGDI2相比，RhoGDI2-Y153E减少了小鼠肺肿瘤的负担，抑制肿瘤转移能力增强^[13]。可以推测RhoGDI2-Y153E膜定位可能参与RhoGDI2介导的抑制转移，虽然通过何种机制仍未明确。另外，Wu等^[22]的研究也表明，293T细胞外源表达的RhoGDI2只与Rac1结合，而与Rac2，Rac3，RhoA，RhoC或Cdc42不结合，无论在体外还是体内，活化的Src在Tyr153位点结合和磷酸化RhoGDI2，较少见于Tyr24位点。由Src的磷酸化降低了RhoGDI2与Rac1的结合能力，增强其阻断转移的能力。因此，肿瘤细胞迁移和侵袭需要RhoGDI2介导Rac1的活化。 3.2 Src对RhoGDI2的作用

在mRNA和蛋白水平，Src的激活、表达与膀胱癌分期呈负相关，即分期越高，Src激活的越少。在膀胱癌中，Src的表达与RhoGDI2的表达呈负相关，表明这两种蛋白在相同的肿瘤中不同时下调表达，同时表明它们可能涉及相同的信号转导通路^[22]。在对T24膀胱癌细胞研究时发现，Src的表达水平和活性高低，可作为膀胱切除术后患者的预后指标。RhoGDI 2蛋白在肿瘤中与Src激酶两者共表达可抑制肿瘤转移。Src结合并磷酸化RhoGDI2从而导致转移抑制能力增强^[23]。Src通过负调控p190RhoGAP抑制转移，随后通过Rho相关蛋白激酶（ROCK）通路介导抑制RhoA和RhoC蛋白，该通路对细胞迁移很重要^[24]，其可能机制是Src和RhoGDI2协同影响ROCK信号通路抑制迁移，也可能是通过调节Rho活性抑制转移。表明Src介导RhoGDI2的磷酸化提高了其转移抑制活性^[22]。上述研究成果证明了RhoGDI2的Src磷酸化位点可能通过改变与膜结合的Rac1影响其转移抑制功能。3.3 PKCα介导RhoGDI2的磷酸化

RhoGDI 2在膀胱肿瘤表达缺失常与转移相关，约35%转移性膀胱癌患者保留RhoGDI2蛋白的表达。虽然有其他因素可能在这些患者的转移中起作用，但可以确定可能存在翻译后机制灭活RhoGDI2的途径。近来，PKCα（蛋白激酶Cα）介导RhoGDI2的又一磷酸化位点得到确定，即31丝氨酸位点。在这个位点的磷酸化降低RhoGDI2与Rac1结合，随之增加Rac1的膜定位和Rac1激活，降低RhoGDI2活性^[25]。RhoGDI2的31丝氨酸位点周边的结构分析提示：Ser31覆盖RhoGDI2N-末端区域的螺旋发夹结构，这个结构接触GTP酶开关的区域，对与GTP酶的结合是必不可少的^[26]。丝氨酸31位点的磷酸化可能动摇了N-末端的螺旋发夹结构，有可能会减少RhoGDI2与Rac1的结合。研究证实：在表达野生型WT-RhoGDI2的实验组中，小鼠转移肿瘤几乎完全被抑制；而表达S31ERhoGDI2的实验组丧失了转移抑制作用，该组小鼠肺转移瘤的形成与对照组相似。S31E-RhoGDI2无法抑制实验小鼠肺转移瘤的形成这一发现很重要，因为改变P KCα的活性也可能导致表达RhoGDI2膀胱癌转移能力的改变。免疫组织化学的结果表明，膀胱癌分期越高，PKCα蛋白表达水平也越高，或者活性越强^[27]。虽然上述研究的样本规模相对较小，其结论应进行更全面的分析，但上述研究结果提示，PKCα激活和随后在转移性膀胱癌RhoGDI2-Ser31位点的磷酸化可能是膀胱癌RhoGDI2转移抑制能力灭活的一种替代机制。 4 RhoGDI2抑制膀胱癌转移的其他机制

Said等^[28]表明RhoGDI2能影响膀胱癌的微环境。RhoGDI2通过降低肿瘤炎性反应抑制肿瘤转移。RhoGDI2抑制转移的功能和炎性细胞刺激因子多功能蛋白聚糖（versican）V1和V3亚型表达密切相关。在RhoGDI2过表达模型，多功能蛋白聚糖被抑制最为严重，表达下降超过8倍。膀胱癌标本中，RhoGDI2与多功能蛋白聚糖mRNA表达呈负相关。多功能蛋白聚糖在浸润性膀胱癌中的表达明显高于非浸润性膀胱癌，多功能蛋白聚糖mRNA的高表达与患者的预后呈负相关。在UMUC3细胞中，RhoGDI2的高表达能在转录水平明显抑制多功能蛋白聚糖的V1、V2和V3亚型。RhoGDI2在UMUC3细胞重新表达后，不但肺转移结节缩小，而且转移结节的数目也减少。RhoGDI2高表达的肺转移病灶巨噬细胞浸润减少，表达RhoGDI2的膀胱癌细胞降低了细胞因子IL-6和趋化因子CCL2的表达和COX-2（环氧酶-2）的活性，从而抑制了肿瘤局部炎症环境，进而抑制了转移。

多功能蛋白聚糖能与黏附分子、趋化因子、生长因子等结合，影响肿瘤生长微环境。多功能蛋白趋化肿瘤周围炎性细胞浸润。严重的炎性反应能诱导多功能蛋白聚糖高表达、巨噬细胞的浸润，进而加剧炎性因子及细胞介质的分泌，并促进了CCL2、IL-6等介质浸润，进而促进肿瘤细胞转移，这反映了炎性微环境对肿瘤转移的影响^[29]。

多功能蛋白聚糖的表达由部分细胞因子、趋化因子和缺氧调节，其机制可能涉及转录因子TCF-4、SP-1、AP-1和p53。CCL2/CCR2涉及多功能蛋白聚糖发挥作用的通路可能由NF-κB和AP-1调节^[29]。RhoGTP通过激活p38MAPK激酶等途径（其中Rac是该通路中的关键组分），诱导炎性介质IL-6和IL-8的合成，进而诱导肿瘤转移^[30]。

Gildea等^[7]在寻找跟膀胱癌转移相关的基因时，除发现RhoGDI2外，还发现了ET-1（内皮素-1），与RhoGDI2表达呈负相关，ET-1在高分级和高分期膀胱肿瘤标本的表达增强，在T24T的表达高于T24细胞系，且增高幅度最大。ET-1和（或）其受体的过表达在细胞存活，血管生成和肿瘤转移中发挥重要作用^[31]。RhoGDI2能下调ET-1和神经介素U（NeuromedinU），引起血管收缩^[32]。但多功能蛋白聚糖和ET-1对RhoGDI2发挥其转移抑制的效果尚存争议，目前可以明确的是RhoGDI2可对肿瘤转移微环境中的炎性因子进行负调节，而RhoGDI2下调ET-1和多功能蛋白聚糖可能就是其抑制转移的重要机制。RhoGDI2还通过调节肿瘤细胞的侵袭和迁移起着关键作用的还有β1整合素，调节膀胱肿瘤细胞的侵袭性^[33]。 5 总结和展望

综上所述，RhoGDI2基因是明确的膀胱癌转移抑制基因，其作用机制是RhoGDI2作为RhoGTP酶的GDP解离抑制因子，调节RhoGTP酶在活性状态和非活性状态之间的循环转换，以活化或抑制下游效应因子，如与肿瘤转移相关细胞外基质ECM和微管运动。另外，本文对影响RhoGDI2功能的一些分子机制也进行回顾，如RhoGDI2与Rac1之间的关系、RhoGDI2的磷酸化。目前发现RhoGDI2的磷酸化位点包括Tyr-156、Tyr-24、Tyr-125、Tyr-153、Tyr-172和Ser-31。RhoGDI2还能影响肿瘤生长的微环境以及多功能蛋白聚糖、CCL2/CCR2，以对肿瘤细胞的转移发挥作用。现阶段人们对RhoGDI2的研究主要是考虑开发针对RhoGDI2基因的靶向治疗途径及药物，因此，虽然RhoGDI2抑制膀胱癌转移的分子机制研究取得了一定的成果，但仍需进一步了解RhoGDI2基因表达改变对于膀胱癌局部复发、远处转移过程的影响，探索两者的改变是否是一个序贯变化的过程，并建立动物模型和进行靶向药物相关研究，期待RhoGDI2可作为抑制膀胱肿瘤转移的靶向分子，开辟出一条新的膀胱癌分子靶向治疗途径。