肿瘤防治研究  2014, Vol. 42 Issue (2): 136-141
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

郭卓雨,高丽萍,赵艳萌,刘思璐. 2015.
GUO Zhuoyu,GAO Liping,ZHAO Yanmeng , LIU Silu. 2015.
葡萄籽原花青素对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4损伤的保护作用
Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Cisplatin-induced Damage in Mice Testes Sertoli Cells TM4
肿瘤防治研究, 2015, 42(02): 136-141
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2015, 42(02): 136-141
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2015.02.008

文章历史

收稿日期:2014-09-22
修回日期:2014-12-09
葡萄籽原花青素对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4损伤的保护作用
郭卓雨, 高丽萍, 赵艳萌, 刘思璐    
100191 北京,北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京联合大学应用文理学院
摘要目的 研究葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)对顺铂(Cisplatin, cDDP)诱导的小鼠睾丸支持细胞TM4损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养正常小鼠睾丸支持细胞TM4,MTT法测定GSPE、cDDP分别对TM4细胞生长的影响以及GSPE对cDDP诱导的TM4细胞损伤的保护作用,硫代巴比妥酸法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)含量,二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)、一氧 化氮合酶(NOS)含量,同时观察细胞形态学变化。结果 GSPE可显著增强TM4细胞存活率,抑制cDDP对TM4细胞的毒性作用,降低细胞内MDA、NO、NOS含量,减缓SOD、GSH、GSHPx 耗竭,对cDDP诱导TM4细胞抗氧化酶活力降低和脂质过氧化物含量升高有显著抑制作用(P<0.01)。结论 GSPE能有效抑制cDDP诱导的TM4细胞氧化性损伤,其机制可能与GSPE的抗氧化作用相关。
关键词葡萄籽原花青素     顺铂     小鼠睾丸支持细胞     氧化应激    
Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Cisplatin-induced Damage in Mice Testes Sertoli Cells TM4
GUO Zhuoyu, GAO Liping, ZHAO Yanmeng, LIU Silu    
Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substance and Functional Food,College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China
AbstractObjective To investigate the protective effect of grape seed proanthocyanidin extract(GSPE) on cisplatin(cDDP)-induced testicular toxicity in mouse testes sertoli cells TM4 and its possible mechanism. Methods GSPE and/or cDDP were administered to TM4 cells. The survival rate of the cells was evaluated by MTT assay. Malondialdehyde(MDA) content was measured by thiobarbituric acid way. Nitric oxide(NO) and nitricoxide synthase(NOS) content were detected by nitrate reductase way. Superoxide dismutase(SOD) content was examined by xanthine oxidase method. Glutathione(GSH) and glutathione peroxidase(GSH-Px) content were determined by nitrobenzoic acid method. In addition, morphological changes of the cells were observed by microscopy. Results GSPE could significantly enhance the survival rate of TM4 cells, inhibit the toxic effect of cDDP on TM4 cells, and decrease the content of MDA, NO, NOS, while SOD, GSH, GSH-Px depletion were slowed. GSPE had a significant inhibitory effect to decrease the content of antioxidase and increase the level of lipid peroxide on cDDP-induced TM4 cells (P<0.01). Conclusion The cDDP-induced damage in intracellular findings of TM4 cells could be remarkably reversed by GSPE, which may be related with the antioxidant potential of GSPE.
Key words: Grape seed proanthocyanidin extract(GSPE)     Cisplatin     Oxidative stress     Mouse testes sertoli cells TM4    
0 引言

顺铂(cisplatin,cDDP)是一种交联DNA的抗肿瘤药物,现已广泛用于多种癌症治疗,尤其对睾丸癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等最为有效[1],然因毒性累积作用而使其在临床的使用剂量受到限制[2]。研究表明,cDDP限制性不良反应主要表现为肾毒性和睾丸损伤,许多男性患者表现出不育症状[3,4]

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是从葡萄籽中提取的一大类多酚类黄酮化合物,因其结构中存在较多酚羟基而具有较强还原性,使得GSPE一直被认为是强有效的抗氧化剂。本研究结合cDDP所致生殖细胞作用及GSPE活性,研究cDDP对TM4细胞生存率、氧化损伤作用及GSPE对cDDP诱发TM4细胞毒性作用的影响,探讨cDDP所致生殖毒性的机制和GSPE的防护作用及其机制,为GSPE应用于临床,提高cDDP化疗效果提供实验依据,为男性癌症患者提供有效的化疗辅助用品。1 材料与方法1.1 材料与试剂

TM4细胞呈上皮样、贴壁型生长正常小鼠睾丸支持细胞,由中国协和医科大学提供。顺铂(批号H37021358,齐鲁制药公司);葡萄籽原花青素提取物(天津尖峰天然产物研究开发有限公司);新生牛血清及DMEM/F12培养液(美国Gibco公司);胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒均由南京建成科技有限公司提供;其他试剂均为分析纯。1.2 细胞培养

TM4细胞采用含双抗(100 μg/ml链霉素,100 u/ml青霉素)及含10%新生牛血清的DMEM/F12培养液,并置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。取对数生长期细胞进行实验。1.3 细胞毒性实验

MTT比色法测定cDDP对TM4细胞的毒性作用、GSPE对TM4细胞生长的影响,以及GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用。1.3.1 cDDP对TM4细胞的毒性作用

将200 μl(1×104个/毫升)TM4细胞接种至96孔培养板,待细胞生长至融合状态后进行实验。设定cDDP浓度梯度(每孔200 μl),加入不同终质量浓度cDDP(0、0.00075、0.0015、0.003、0.006、0.012、0.048、0.096、0.192 mg/ml,其中0 mg/ml组加入同等体积无血清培养液作空白对照),各浓度设定6个平行孔,培养24 h。向上述96孔培养板中加入终质量浓度为0.5 mg/ml MTT,于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h,弃废液并加入DMSO(每孔150 μl),混匀10 min,酶标仪检测(测定波长570 nm,参比波长630 nm)吸光度(A)。以不加cDDP为空白对照,计算细胞抑制率。依据抑制率计算cDDP对TM4细胞的半数抑制浓度(IC50值),并作为后续实验参照依据。细胞抑制率(%)=1-A1/A0×100%,式中:A1为实验组上清液的吸光度;A0为空白对照组上清液的吸光度。1.3.2 GSPE对TM4细胞生长的影响

将200 μl(1×104个/毫升)TM4细胞接种至96孔培养板,待细胞生长至融合状态后,设定GSPE浓度梯度(每孔200 μl),加入不同终质量浓度GSPE(0、0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、1.500、2.000 mg/ml,0 mg/ml组加入同等体积无血清培养液作空白对照),各浓度设定6个平行孔,培养24 h。按MTT法步骤测定吸光度值,计算细胞抑制率。依据抑制率计算GSPE对TM4细胞的半数抑制浓度(IC50值),并作为后续实验参照依据。 1.3.3 GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用

同1.2所述方法对细胞进行培养,设定空白对照组(加入同等体积无血清培养液);cDDP模型组(0.014 mg/ml);GSPE+cDDP实验组(加cDDP前2 h加入不同终质量浓度GSPE,使GSPE终质量浓度分别为:0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.250 mg/ml;cDDP终质量浓度0.014 mg/ml),每组6个复孔,MTT法测定吸光度A值,计算细胞存活率。细胞存活率(%)= A1/A0×100%,式中:A1为实验组上清液的吸光度值;A0为空白对照组上清液的吸光度值。1.4 细胞形态观察

同1.2所述方法培养细胞待其生长至融合状态后,将细胞按每孔1×104个接种至6孔板,并于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。设定TM4细胞空白对照组;cDDP模型组(0.014 mg/ml);GSPE+cDDP(GSPE终质量浓度:0.005 mg/ml;cDDP终质量浓度:0.014 mg/ml);GSPE对照组(0.005 mg/ml)。细胞经相关处理后,用显微成像系统拍摄并保存图像,比较各组细胞生长形态的差异。1.5 GSPE对cDDP诱导TM4细胞内抗氧化指标的影响

根据1.3.3所得实验结果,选取GSPE(0.005 mg/ml)预先对细胞进行保护,并于2 h后加入cDDP(0.014 mg/ml),置37℃、5%CO2培养箱中进行培养,24 h后终止,消化并收集细胞,PBS冲洗,离心弃上清液,低温裂解30 min(细胞裂解液:苯甲基磺酰氟PMSF按100:1的比例配制)后,12 000 r/min离心10 min,取上清液即为细胞蛋白匀浆。同时设定空白对照组、cDDP模型组(0.014 mg/ml)及GSPE对照组(0.005 mg/ml)。其中,蛋白含量采用BCA蛋白浓度检测法进行测定,细胞内丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸TBA法测定、SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定、GSH、GSHPx采用二硫代二硝基苯甲酸法测定、NO、NOS采用硝酸还原酶法测定。实验过程严格按试剂盒测定说明进行实验。1. 6 统计学方法

实验所得数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析,分别测定cDDP、GSPE对TM4细胞的半数抑制浓度(IC50),单因素方差分析进行多组间比较(检验水平α=0.01),结果以平均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 cDDP对TM4细胞的生长抑制作用

随cDDP终质量浓度增大,TM4细胞抑制率不断增高,且二者呈现明显的剂量依赖关系。各浓度cDDP对TM4细胞抑制率与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。cDDP对TM4细胞IC50值为(0.014±0.0003) mg/ml,见图 1

#: P<0.01,compared with the control group 图 1 cDDP对TM4细胞的生长抑制作用 Figure 1 The inhibitory effect of cDDP on TM4 cells
2.2 GSPE对TM4细胞生长的影响

随GSPE质量浓度的升高,TM4细胞存活率逐渐增高,当GSPE质量浓度达到0.010 mg/ml时,TM4细胞存活率达最大值,此后随GSPE质量浓度增加,TM4细胞存活率逐渐降低。当GSPE质量浓度高于0.500 mg/ml,TM4细胞存活率明显低于空白对照组,即高质量浓度GSPE对TM4细胞生长具有抑制作用。GSPE 24 h IC50值为(0.956±0.0012) mg/ml,见图 2

*: P<0.01,compared with the control group 图 2 GSPE对TM4细胞存活率的影响 Figure 2 Effect of GSPE on survival rate of TM4 cells
2.3 GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用

用终质量浓度为0.014 mg/ml的cDDP孵育TM4细胞24 h建立cDDP诱导TM4细胞毒性模型,设定不同浓度GSPE拮抗cDDP细胞毒性。由图 3可知,cDDP模型组与空白对照组相比,cDDP对TM4细胞有明显的抑制作用,加入不同终质量浓度GSPE(0.001~0.050 mg/ml)对cDDP诱导TM4细胞毒性作用有一定的保护作用,且在0.005 mg/ml最为显著。结果表明,一定终质量浓度GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性有明显的保护作用。

#: P<0.01,compared with the control group; *: P<0.01,compared with cDDP group; 1: control; 2: cDDP; 3: cDDP+0.001mg/ml GSPE; 4: cDDP+0.005mg/ml GSPE; 5: cDDP+0.010mg/ml GSPE; 6: cDDP+0.020mg/ml GSPE; 7: cDDP+0.050mg/ml GSPE; 8: cDDP+0.100mg/ml GSPE; 9: cDDP+0.200mg/ml GSPE; 10: cDDP+0.250mg/ml GSPE 图 3 GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用 Figure 3 Protective effect of GSPE on cDDP-induced neurotoxicity in TM4 cells
2.4 TM4细胞形态观察

实验结果表明,一定质量浓度GSPE可缓解cDDP对TM4细胞的毒性作用,对cDDP诱导TM4细胞形成的细胞形态变化具有拮抗作用,见图 4

Cells were observed under inverted microscope to detect morphological changes. A: the morphology of normal TM4 cells. The cells were spindle shaped or polygonal,and adherent closely one by one. It showed clearly morphology; B: the morphology of cDDP-induced TM4 cells. Majority of the cells became round. A large number of the cells detached from the culture bottle,the number of adherent cells were significantly reduced; C: the morphology of CDDP-induced TM4 cells morphology after pretreatment of GSPE. The phenomenon shedding and turning round of the cells were less than Figure B. The shapes of the cells were spindle shaped or polygonal. Only a few of them had weakening attached abilities; D: the morphology of TM4 cells treated with GSPE alone. The cells attached to the wall closely. The edges of the cells were visible clearly. The morphology and the growth status of the cells were similar to Figure A. There were no obviously changes between Figure A and D A: control group; B: cDDP (0.014 mg/ml) group;C: GSPE(0.005mg/ml)+cDDP(0.014 mg/ml) group; D: GSPE (0.005 mg/ml) group 图 4 GSPE对cDDP诱导TM4细胞生长形态的影响(×100) Figure 4 Effect of GSPE on cDDP-induced morphology changes in TM4 cells (×100)
2.5 GSPE对cDDP诱导TM4细胞内抗氧化指标的影响

cDDP诱导下的TM4细胞内MDA、NO、NOS含量与正常对照组相比显著升高(P<0.01),SOD、GSH、GSH- Px酶活力显著降低(P<0.01);若细胞先经GSPE作用,再由cDDP诱导,则细胞内MDA、NO、NOS含量与cDDP模型组相比显著降低(P<0.01),SOD、GSH、GSHPx活性显著升高(P<0.01)。实验同时测定GSPE对TM4细胞抗氧化指标的影响,可知GSPE可显著降低正常TM4细胞内MDA、NO含量,提高SOD及GSH-Px含量(P<0.01)。实验结果表明,GSPE能有效拮抗cDDP诱导TM4细胞氧化损伤,增强TM4细胞内抗氧化酶活力,降低MDA、NO含量,抑制NOS活性,同时显示GSPE对正常TM4细胞具有明显的抗氧化作用,见表 1

表 1 GSPE对cDDP诱导TM4细胞内抗氧化指标的影响 Table 1 Effect of GSPE on cDDP-induced antioxidant index in TM4 cells
3 讨论

支持细胞又称Sertoli细胞,对精子的形成及男性生殖健康具有重要作用。当支持细胞出现基因缺陷时,精子无法正常生成[5,6],它是调节精子发生的重要信号靶体,也是各种药物作用于睾丸的第一靶细胞[7]。任何影响支持细胞功能的因素都有可能影响精子的形成,更甚者造成男性不育[8]。据报道,急性接触抗癌药物(如cDDP)会导致生殖细胞凋亡率升高,同时致使睾丸支持细胞和睾丸间质细胞出现功能性障碍等[9]

目前,cDDP诱导生殖细胞凋亡以及体细胞(如支持细胞)损伤的分子机制尚不明确,对睾丸支持细胞损伤的确切作用机制仍不清楚。研究表明,cDDP所致睾丸损伤已被归因于cDDP直接损害生精细胞[10]、睾丸支持细胞[11]等。相关文献报道,cDDP诱导睾丸损伤的发病机制一般归因于氧化应激[12]。cDDP在机体内产生大量氧自由基,损害线粒体,使线粒体空泡化,从而对机体造成氧化性损伤[13]。这些氧自由基还会与生物膜上不饱和脂肪酸反应,引起膜脂质过氧化,导致膜通透性和膜脂质流动性改变,同时可产生多种有毒降解产物。其中脂质过氧化主要产物丙二醛(MDA)含量变化可反映机体内自由基代谢的异常及脂质过氧化速率。已有研究表明,cDDP可引起血浆、精子和睾丸组织中MDA含量的增加[14]。Ateşşahin等[15]在对大鼠睾丸研究中也得出,经cDDP处理过的雄性SD大鼠睾丸组织内MDA升高的相似结论。一氧化氮(NO)与羟自由基关系密切,当机体L-精氨酸缺乏或一氧化氮合酶(NOS)活性增强时,可与超氧化物阴离子反应生成超氧化亚硝基阴离子(ONOO),此物质可分解产生羟自由基(•OH)这可能是引发细胞毒性的潜在原因。NO水平升高源于NOS活性的增强。NOS用于催化L-精氨酸与分子氧反应生成NO并扩散至细胞外,被认为是新型信息传递分子。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内一种金属蛋白酶,对超氧阴离子自由基具有专一性抑制作用,可保护机体免受超氧阴离子自由基的损伤[16],其活性的降低可导致超氧阴离子的增多。谷胱甘肽(GSH)是正常细胞防御外来有毒化合物或抵御机体内氧化应激反应的重要化合物,GSH可直接或通过抗氧化酶间接作用ROS的分解并对致癌物进行解毒,GSH缺乏或耗竭都会促使许多化学物质或环境因素作用于机体而使机体产生中毒或加重机体中毒作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)是机体内广泛存在的一种重要过氧化氢分解酶,在细胞内能清除有害过氧化代谢产物,阻断脂质过氧化连锁反应,起保护细胞膜结构和功能的完整性的作用。在过氧化氢酶极少的组织中,主要靠GSH-Px来清除体内过氧化氢[17]。许多研究已表明,使用抗氧化物质进行干扰或保护的方法可以减轻cDDP所致生殖功能障碍[14,18,19]。本实验结果表明,cDDP可导致TM4细胞抗氧化指标改变,过量自由基生成则是这些抗氧化指标变化的一个潜在因素。

文献表明,GSPE在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、防护心血管等方面都具有显著疗效,尤其在体内或体外清除自由基和抗氧化方面更为显著[20,21,22] ,对与氧化应激相关的疾病具有拮抗作用[23,24]。大量研究报告表明,GSPE不仅具有抗肿瘤活性,还可降低化疗药物对正常细胞的毒性作用[25,26,27],故可作为一种减轻癌症化疗药物所引起机体正常细胞的毒性的潜在化学防护剂。本实验研究证实,GSPE可通过增强TM4细胞内抗氧化物GSH含量(P<0.01)及SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性(P<0.01),降低MDA、NO的含量以及NOS活性(P<0.01)阻抑cDDP诱导TM4细胞内三种抗氧化酶活性的降低及脂质过氧化物的增高,从而表明GSPE可通过阻抑脂质过氧化反应,增强抗氧化酶活性,拮抗cDDP诱发机体氧化应激作用,有效抑制cDDP诱导TM4细胞的氧化性损伤,故其作用机制可能与GSPE强抗氧化活性有关。

本实验从cDDP诱导生殖细胞氧化性损伤作用及GSPE抗氧化作用来探讨cDDP所致生殖毒性及GSPE保护作用的机制,然而cDDP诱发正常生殖细胞凋亡和GSPE是否通过阻抑细胞凋亡来拮抗cDDP诱导的生殖细胞毒性作用及其信号转导通路等仍需进一步研究。

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