结肠癌是全球3种常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例超过100万。结肠癌的发生发展涉及多种基因，包括多种癌基因、抑癌基因和错配修复基因，通过染色体不稳定、微卫星不稳定（microsatallite instability，MSI）和基因启动子CpG岛甲基化等机制参与结肠癌的演变过程^[1]，其中MSI在约15%结肠癌中被检测到。微卫星不稳定状态的评估能指导结肠癌的治疗、监测复发和治疗反应，评估预后。因此，我们拟通过免疫组织化学及聚合酶链反应两种方法检测结肠癌中微卫星状态，比较两者的一致性，评估免疫组织化学在检测微卫星状态中的临床应用价值。

收集2012年1月6日—2014年12月31日在苏州大学附属常州肿瘤医院行手术治疗的结肠癌切除标本80例。所有患者术前均未进行放化疗或分子靶向治疗。手术切除后标本于30 min内经4%中性甲醛充分固定，次日多点取材、脱水及石蜡包埋后备用。研究方案经本院伦理委员会批准，受试者均知情同意。

选取同时有肿瘤和正常组织的石蜡切片，在美国罗氏公司BenchMarkXT全自动免疫组织化学染色机上进行错配修复蛋白检测。抗MLH1、抗PMS2、抗MSH₂、抗MSH6抗体均购自北京中杉生物技术有限公司。操作步骤均严格按照罗氏诊断优化程序进行。基本过程如下：4 μm切片脱蜡，3%H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活动，抗原修复，滴加10%正常山羊血清封闭非特异染色后，顺序加一抗、二抗室温静置1 h后，DAB染色，苏木精对比染色，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察结果。正常结肠腺体上皮及间质细胞、淋巴细胞作为内对照。结果判定：当正常肠黏膜细胞或间质细胞核染色为棕色时，观察肿瘤细胞的染色情况：全部肿瘤细胞核蓝染为阴性表达；1个以上肿瘤细胞核出现阳性反应时即认定阳性表达，且其中任意1个以上蛋白表达缺失则视为高频微卫星不稳定状态。由两位经验丰富的病理医师独立判定。

采用基因组DNA提取试剂盒（购自上海赛百盛基因技术有限公司）选取仅有肿瘤组织和仅有正常黏膜组织的蜡块各80例，分别提取总DNA，紫外分光光度计定量后备用。

选择美国国立癌症研究所推荐的5个标记位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250）进行MSI研究。所有引物序列根据基因数据库（GDB,http://www.gdb.org）合成。将肿瘤与其对应的正常组织基因组DNA的PCR结果进行比较。每对引物用荧光物FAM进行标记。多核苷酸序列通过多对引物的多重PCR同时进行扩增。PCR反应体系为1 μmol/L引物，200 mol/LdNTP，1.5 mmol MgCl₂，0.75 u Taq DNA聚合酶。PCR反应条件: 94℃预变性5 min，变性94℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。循环后72℃再延伸7 min。所有产物通过测序仪进行测序分析，并用软件分析产物的大小。如果小于2个位点改变则为微卫星稳定（microsatallite stability,MSS） 或低频微卫星不稳定（microsatallit einstability-low,MSI-L），2个及以上位点改变则为高频微卫星不稳定（microsatallite instability-high,MSI-H）。

采用SPSS17.0统计软件进行分析，卡方检验分析免疫组织化学和PCR检验结果的一致性。P<0.05为差异有统计学意义。

80例均可判读，其中10例因无内对照或染色背景太强，重新染色后获得满意结果。检出成功率达100%。所有切片癌旁组织中正常黏膜腺上皮细胞核及间质中淋巴细胞核染色阳性，作为自身阳性内对照，见图 1A。癌细胞核染色示为阳性表达，见图 1B。80例结肠癌组织中，MLH1蛋白缺失表达19例，见图 1C。PMS2蛋白缺失表达17例，16例为MLH1/PMS2共同缺失表达。MSH6蛋白缺失表达6例，其中3例与MLH1/PMS2共同缺失表达。MSH₂蛋白缺失表达3例，均与MSH6共同缺失表达。MLH1、PMS2、MSH6、MSH₂蛋白表达缺失率分别为23.8%（19/80）、21.2%（17/80）、7.5%（6/80）、3.7%（3/80）。19例（23.8%）显示为高频微卫星不稳定。

A: positive expression of MLH1 protein in colorectal cancer cells nucleus; B: negative expression of MLH1 protein in colorectal cancer tissues; C: positive expression of MLH1protein in normal mucosal tissues 图 1 MLH1在结肠癌及正常黏膜中的表达 (SP ×100) Figure 1 MLH1 protein expression in colorectal cancer and normal mucosal tissues (SP ×100)

图选项

PCR产物测序结果显示80例结肠癌组织中18例为高频微卫星不稳定，5例为低频微卫星不稳定，其余病例均为微卫星稳定状态。具有微卫星不稳定的病例均显示Bat25位点具有不稳定性。而高频微卫星不稳定的病例中均同时显示Bat25、Bat26位点不稳定，部分病例同时显示另外三个位点（D2S123、D5S346、D17S250）具有不稳定性（图 2A~E分别表示检测的5个位点的不稳定，均以正常黏膜组织作为对照）。正常黏膜组织则均表现为微卫星稳定状态。

A: Bat25; B: D2S123; C: D5S346; D: D17S250; E: Bat26; Tumor tissues DNA showed the alteration of allete lengths in Bat25,D2S123, D5S346,D17S250 and Bat26,compared with their corresponding nontumor adjacent tissues DNA 图 2 PCR检测高频微卫星不稳定结果 Figure 2 PCR analysis results of microsatellite instability

图选项

19例错配修复蛋白缺失（一个及以上的蛋白）的病例PCR检测，其中17例存在两个及以上位点的不稳定，即高频微卫星不稳定性，另外2例则显示仅Bat25位点不稳定或无位点显示不稳定，即低频微卫星不稳定或微卫星稳定。而1例PCR检测为高频微卫星不稳定性的病例，免疫组织化学显示无任一蛋白缺失表达。PCR检测MSI与免疫组织化学结果的总体符合率为90%（17/19），具有高度的一致性（P＜0.05），见表 1。

表 1 80例结肠癌错配修复蛋白免疫组织化学与PCR检测结果比较 (例) Table 1 Comparison between IHC and PCR of MSI protein status in 80 colorectal carcinoma (n)

表选项

2例免疫组织化学检测为MSI-H，但PCR未检测到5个位点不稳定。

MSI是指在DNA复制过程中由于错配修复系统的缺陷而导致短的重复DNA序列（微卫星）发生高频的插入或缺失等改变。参与错配修复系统的蛋白包括两个二聚体：MLH1/PMS2、MSH₂/MSH6。大量研究已表明MSI状态不仅与结肠癌预后和进展有关，而且与结肠癌用药有关。报告提示MSI-H患者预后更好，但单独使用5-Fu效果不佳^[2]。目前达成的共识为：对所有的结肠癌患者，无论是遗传性或散发性，都推荐通过免疫组织化学或PCR等方法检测MSI状态^[3]。目前常用的检测方法包括三种：免疫组织化学、PCR、DNA测序法。而PCR被认为是检测MSI的金标准，它主要通过从肿瘤组织和正常组织中提取DNA后，进行微卫星位点的扩增，将扩增的片段进行比较，以检测微卫星位点的不稳定性。虽然各实验室的检测位点不同，但目前较为公认的是NCI推荐的5个位点即：Bat26、Bat25、D2s123、D5s346和D17s250。大于2个位点显示不稳定则诊断MSI-H，只有1个位点不稳定则诊断为MSI-L，没有位点不稳定则为MSS。免疫组织化学是通过检测肿瘤组织中MMR蛋白缺失情况确定MSI状态。任一蛋白表达缺失则提示MSI-H，但要有非肿瘤细胞包括淋巴细胞或正常黏膜上皮细胞核显色作为阳性内对照。肿瘤细胞通常较正常细胞显色更强烈。大多数实验室通常检测4个错配修复蛋白，即MLH1、MSH₂、MSH6和PMS2。DNA测序是直接检测编码修复蛋白的基因突变情况。但它也有局限性：不能检测出基因启动子的甲基化情况，而甲基化是高频微卫星不稳定状态的常见原因。

以上三种方法各有优缺点。PCR虽然是诊断MSI的金标准，结果的可重复性强，但它对标本固定的要求很高，尤其不能用于某些固定液如Boin液，且需对肿瘤组织与正常黏膜组织分别提取DNA进行比较分析，才能得出可信的结果，因此要有足够的肿瘤组织和相应的正常组织，有些活检标本肿瘤成分少，或无足够的正常组织，因此不能用于PCR检测。PCR实验周期较长，需5天~2周的时间；对实验室的条件要求高，实验人员还需经严格的专业训练。而免疫组织化学法价格便宜、周期短、且操作简单，对实验室条件要求不高，评价标准也容易掌握，很少出现假性结果。通过DNA测序法可以得到基因突变的直接证据，但它不能提供基因功能的异常证据，且和PCR一样，要求高、价格昂贵、周期长，不能在实验室普遍开展。

本实验研究显示免疫组织化学和PCR方法检测MSI结果具有高度的一致性，免疫组织化学能成功地检测出具有MSI-H的所有病例，所有免疫组织化学均有明确的内对照，肿瘤细胞染色强于正常的黏膜组织，显示清晰的肿瘤细胞核阳性，间质中淋巴细胞染色阳性。

对于免疫组织化学与PCR评估肿瘤MSI状态的符合率，Amira等^[4]报道两者具有高度的一致性，并指出免疫组织化学可以用来检测结肠癌中MSI状态。Gibson等^[5]也指出所有的结直肠癌，包括散发性或与遗传有关的，都推荐检测MSI状态，而免疫组织化学较之其他方法有不可替代的优势。几种检测方法所得出的结果能提供不同的信息^[6]：PCR检测结果不能显示4种修复蛋白中哪种蛋白功能缺陷，因此它不能区分与MSI有关的结直肠癌是散发性或是Lynch Syndrome有关的。而免疫组织化学结果可以显示每个修复蛋白的表达情况，因此能提供肿瘤发生的病因学信息。MSH₂/MSH6表达缺失则提示肿瘤的发生与Lynch Syndrome有关，而MLH1/PMS2表达缺失则是散发性结直肠癌的特点。因此如果4个修复蛋白均无缺失，则可以诊断为MSS，无需进一步PCR检测，除非该患者存在明显Lynch Syndrome高风险可能。目前大量文献认为免疫组织化学是一个重要的初筛方法，可根据免疫组织化学结果决定是否进一步行PCR检测。本实验结果提示癌组织中丢失的标本主要是MLH1，几乎每例MSI-H的病例中均存在该蛋白的缺失表达。PCR检测结果则提示BAT25、BAT26两个位点不稳定在MSI-H中普遍存在，可以作为检测MSI的首选位点。

综上所述，免疫组织化学方法检测MSI状态与PCR检测结果具有较高的符合率，可以检测结肠癌MSI状态，具有实际应用价值，在临床实践中需特别注意严格的判定标准及内对照。