由于乙型病毒肝炎患者众多，我国是原发性 肝癌，尤其是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）全球第一大国，发病率和死亡率均较高。 攻克HCC已成为临床亟待解决的重大课题之一， 然而迄今HCC的发病机制仍未明了^[1]。近年来， 缝隙连接（gap junction,GJ）结构和功能的研究为 探索多种肿瘤的发生机制提供了新思路^{[2, 3]}。GJ是 一种直接沟通两个相邻细胞胞质的蛋白质连接通道，由特殊的通道蛋白—缝隙连接蛋白（connexin, Cx）组成。Cx是多基因家族编码的一类结构相似 而分子量不同的蛋白质，目前在人类共发现有20 余种^[4]，其中Cx43表达最为广泛，在人类几乎所有 组织和细胞中都有表达^[5]。在肝脏组织中，GJ功能 的维持主要涉及3种Cx，即Cx26、Cx32和Cx43^[6]。 目前研究证实，Cx43可能参与了多种肿瘤的发生 发展^{[5, 7]}，但其与HCC的系统性研究较少。因此， 本研究从组织学和细胞学层面综合探讨了Cx43在 HCC中的表达及意义，旨在为HCC的发病机制提 供更多的实验数据和资料。

人正常肝细胞株LO2购自南京凯基生物科技发 展有限公司；人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国 科学院上海细胞库。SP试剂盒购自福州迈新生物 技术开发公司。DMEM培养液及胎牛血清（Gibco 公司，美国）；反转录试剂盒及PCR所用酶、缓 冲液、dNTP等（Promega公司，美国）；Cx43 鼠抗人单克隆抗体（Sigma公司，美国）；HPR 及FITC标记的羊抗鼠二抗（Amersham公司，美 国）；TRIzol，DAPI、钙黄绿素（calcein-AM） 及DiI-CM（Invitrogen公司，美国）；ECL-plus化 学发光试剂盒（Millipore公司，美国）。

2008年1月至2012年12月间经手术切除的存档HCC 蜡块标本76例，术前均未进行任何治疗。另取外 伤性肝切除及意外死亡的正常肝脏组织蜡块20例 作为对照组。

蜡至水化，在柠檬酸缓冲液中微波修复抗原，煮 到沸腾后自然冷却，反复2次，室温下加入1:200稀 释的Cx43一抗，4℃孵育过夜，同时以等量PBS代 替一抗，作阴性对照，滴加1:200稀释的生物素标 记的羊抗鼠二抗，37℃下孵育1 h，滴加链霉素抗 生物素酶免疫复合物（SABC），DAB显色，苏木 精对比染色。光学显微镜下观察阳性染色及细胞 定位并拍照。

位于细胞质或细胞膜。细胞内出现黄色颗粒为阳 性细胞。每张切片在高倍镜视野下计数500个肿 瘤或正常肝细胞。根据细胞染色结果将阳性细胞 分为高表达（棕黄色或棕褐色强染色）和低表达（淡黄色弱染色）^[8]。

按RNA抽提试剂盒说明提取总RNA，利用随 机引物进行反转录合成cDNA。反转录产物中加入 特异性Cx43上下游引物继续进行PCR反应。Cx43 引物按照人Cx43序列设计：5'-AGGAGTTCAATCACTTGGCG- 3'（上游），5'-GCAGGATTCGGAAAATGAAA- 3'（下游），产物长度为168 bp； 人β-actin为内参照，引物序列为5'-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTC- 3'（上游），5'-GCATTTGCGGTGGACGAT- 3'（下游），产物长度为130 bp。PCR反应总体积为20 μl，反应条件为：94℃ 预变性3 min；循环参数：94℃变性45 s，58℃退 火45 s，72℃延伸45 s，共36个循环；最后72℃延 伸10 min。取5 μl PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖 凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，凝胶成像系统 照相并分析。

收集对数生长期的LO2和SMMC-7721细胞， 提取细胞蛋白。BCA法测定蛋白含量，根据样品蛋 白浓度，按照蛋白总量40 μg计算体积。蛋白变性 后上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶100 V、 200 mA电泳分离样品蛋白，转印至PVDF膜，封 闭，加入1:1 000稀释的Cx43一抗4℃孵育过夜，滴 加1:5 000稀释的羊抗鼠抗体（二抗）37℃孵育2 h。 ECL显影，曝光。β-actin的表达水平作为内参。

收集对数生长期的细胞爬片，用4%多聚甲 醛＋0.1%Triton X-100室温下固定30 min。滴加一 抗（Cx43鼠抗人单克隆抗体，工作浓度l:200，以 2% BSA稀释），室温下孵育3 h，PBS轻柔冲洗 3次。加入二抗（FITC标记的羊抗鼠二抗，工作 浓度1:200，以2% BSA稀释），室温下避光孵育 2 h，PBS轻柔冲洗3次。加DAPI进行细胞核染色5 min，PBS轻柔冲洗3次，95%甘油封片剂封闭。倒 置荧光显微镜下观察，光源分别激发绿色和蓝色 荧光，采集图像。

隙连接（gap junction,GJ）功能 按照既往研究报道^{[9, 10]}，采用细胞接种荧光 示踪法测定GJ功能。细胞接种至6孔板，生长至 80%~85%融合。取10 μl 25 μmol/L calcein-AM加入 1 ml的无血清培养液混匀。在6孔板其中1孔加入 上述荧光负载液体1 ml，置于5%CO₂、37℃培养箱 中培养30 min，使荧光指示剂进入细胞。吸去负载液，PBS冲洗5 min 3次。用胰蛋白酶消化，加入无 血清培养液中止消化。进行细胞计数，稀释至500 个/毫升，负载荧光的单个悬浮细胞即为“供体细 胞”。在显微镜下观察6孔板其他培养细胞，挑选 生长良好、有GJ形成（已融合）的细胞作为“受体 细胞”。向对应的“受体细胞”加入“供体细胞”液， 1 毫升/孔，置于5%CO₂、37℃培养箱中培养4 h。 待形成稳定的GJ后，小分子的calcein（发绿色荧 光）可以通过GJ进入相邻的“受体细胞”。在倒置 荧光显微镜下，计数一个“供体细胞”周围有无内含 calcein的“受体细胞”及数目，作为GJ功能指标。

使用SPSS17.0软件进行分析。各组间样本率 差异的比较视数据类型采用χ²检验、Fisher精确检 验、Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学 意义。 2 结果 2.1 Cx43在HCC及正常肝脏组织中的表达

正常肝脏组织中Cx43的阳性表达率为90.00% （18/20），HCC组织的阳性表达率为60.53% （46/76），两者比较差异有统计学意义（χ²=6.189, P=0.015），见表 1。针对阳性表达的Cx43颗粒， 其在正常肝脏组织中多呈淡黄色弱染色，而在 HCC中多呈棕黄色或棕褐色强染色，但表达程度 的分布在两组之间差异无统计学意义（U=742.00, P=0.863），见表 1。

表 1 Cx43在正常肝及HCC组织中的表达 Table 1 Cx43 expression in normal liver and HCC tissues

表选项

正常肝脏组织中阳性表达的Cx43呈线状分 布于细胞膜上，偶见细胞质表达，见图 1A~1B； 而在HCC组织中，阳性染色颗粒主要分布于细 胞质内，偶见同时有部分细胞膜着色，即发生了 “内化”（ internalization）现象，见图 1C~1D。内化率在正常肝脏组织及HCC组分别为22.22%和 100%，两组比较差异有统计学意义（χ²=41.358， P=0.000），见表 2。

A, B: normal liver tissues (IHC ×400); C, D: HCC tissues (IHC ×400) 图 1 正常肝及HCC组织中Cx43的表达 Figure 1 Immunohistochemical staining of Cx43 protein in sections of normal liver and HCC tissues

图选项

表 2 Cx43在正常肝及HCC组织中的内化情况 Table 2 Internalization of Cx43 expression in normal liver and HCC tissues

表选项

经统计学分析表明，Cx43蛋白的表达与HCC 患者年龄、性别、组织学分级、TNM分期、肝 病背景、淋巴结转移、脉管癌栓均无关（均P＞ 0.05），见表 3。

表 3 Cx43蛋白的表达与HCC临床病理特征的关系 Table 3 Relationship between Cx43 expression and clinicopathological parameters of 76 HCC patients

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GJ功能状态 RT-PCR和Western blot法联合检测结果显 示，与正常肝细胞株LO2相比，人肝癌细胞系 SMMC-7721中Cx43 mRNA和蛋白表达明显下降， 见图 2A~2B。免疫荧光实验进一步表明LO2细胞上 Cx43的膜定位明显，而在SMMC-7721细胞上，该 蛋白弥散分布于细胞质中，仅有少量呈细颗粒状 定位于细胞膜，见图 2C。LO2细胞GJ功能丰富， 而SMMC-7721细胞GJ功能微弱，如图 2D细胞接种 荧光示踪实验结果所示。

A, B: decreased expression of Cx43 at both mRNA and protein levels in SMMC-7721 cells compared with those in LO2 cells, as shown by agarose gel electrophoresis of RT-PCR products and Western blot, respectively; C: immunofluorescent staining of Cx43 protein in LO2 and SMMC-7721 cells. Normal liver cells showed mainly membranous staining for Cx43, while diffuse cytoplasmic staining for Cx43 in HCC cells was observed (×400); D: GJ activity of SMMC-7721 cells was markedly reduced compared with that of LO2 cells, which was evidenced by parachute dye coupling assay (×200); GJ: gap junction 图 2 LO2及SMMC-7721细胞中Cx43表达、定位及GJ状态 Figure 2 Cx43 expression, localization and functional GJ formation in LO2 and SMMC-7721 cells

图选项

GJ是广泛存在于细胞间介导物质及信息交换 的重要通道，其结构基础为Cx蛋白。当该通道开放 时，一些离子（如Na⁺、K⁺、Ca²⁺等）及其他小分子 调节物质（如第二信使cAMP、cGMP、IP₃ 等）可 以在相邻细胞间通过，进而在控制细胞增殖、促进 分化成熟、诱导凋亡及机体的生长发育等过程中起 重要调控作用。研究表明，Cx及其组成的GJ异常 与肿瘤的发生相关^{[11, 12]}。Cx在大多数肿瘤组织中呈 现表达缺失或低表达状态，而上调Cx表达或改善 GJ功能能够抑制肿瘤的发生或逆转其表型^{[13, 14]}。原 因可能是GJ介导的细胞间通讯功能异常，使机体对 肿瘤细胞的监视和调控能力减弱，肿瘤细胞过度克 隆生长最终形成恶性肿瘤。从GJ结构学上来看，定 位于细胞膜上的Cx才有可能形成功能性的GJ，进 而发挥后续的生物学功能。

Cx43作为Cx蛋白家族的成员之一，在人体中 表达最多，相关研究也最为广泛^[5]。但目前关于 Cx43在不同肿瘤细胞及组织中的表达及确切的功 能仍未明了。例如，在乳腺癌肿瘤细胞系中过表 达Cx43可以抑制肿瘤细胞的增殖和进展^[15]。胃肿瘤组织中Cx43显著低表达，而邻近正常组织表达 正常或轻度降低^{[16, 17]}。然而研究也发现有一些肿 瘤中存在正常甚至高表达的Cx43，如食管癌中的 Cx43蛋白表达较正常组织未减少，肿瘤细胞间的 GJ功能也并未降低^[18]。由此可见，不同种类的恶 性肿瘤，Cx43表达不尽相同，其与肿瘤发生发展 的关系仍需要进一步研究。

本研究结果显示，HCC组织中Cx43蛋白表达 较正常肝脏组织明显下调，表明HCC发生后Cx及其组成的GJ功能是下调的。此外，还观察到Cx43 蛋白在HCC中的定位存在异常：在正常的细胞均 定位于细胞间相互接触的细胞膜，而在HCC中仅 有极少量Cx43定位于胞膜上，Cx43多定位于胞质 内，这种定位上的变化被称为“内化”，在既往关 于另一亚型蛋白Cx32在HCC发生发展过程中的研 究时被发现^[19]。结合本实验结果，推测Cx蛋白的 “内化”现象可能是HCC发生过程中的重要“标志”。 无论哪种亚型Cx蛋白定位上的改变，最终都将导 致GJ功能的降低或缺失。本实验中，虽然阳性表 达的Cx43染色在HCC组较正常肝脏组织更为强 烈，但这些高表达的Cx43不能完全正确定位到细 胞膜上，大部分滞留在胞质内，不能发挥介导GJ 的功能。即可以认为，虽然某些阳性表达的HCC 组织样本中存在高水平的Cx43表达，但这并不表 明这些细胞间的GJ通讯正常。随后的体外实验也 进一步证实了组织学上的研究结果，并且通过细 胞接种荧光实验证实与正常肝细胞株LO2丰富的 GJ通讯功能相比，人肝癌细胞系SMMC-7721只有 部分残存的GJ功能。针对该部分GJ形成的组份， Western blot联合免疫荧光结果提示Cx43有部分表 达且可定位于细胞膜，表明Cx43在该细胞系有参 与形成GJ的条件，但本实验尚不能排除其他Cx亚 型蛋白参与的可能性^[10]。从Cx43表达与HCC临床 病理特征的关系上来看，该蛋白与各因素之间无 明显相关性，表明Cx43在HCC发生过程中所起的 作用可能是早期事件，与后续肝癌细胞的生物学 行为关系不大，同时该结果也在一定程度上提示 HCC细胞中GJ功能组份的复杂性。

目前关于Cx在细胞质中的滞留机制不明，推 测其可能的分子机制有：（1）Cx基因发生突变。 突变的Cx基因将不能介导正常蛋白的生成及生 物学效应的发挥。如在化学诱导致癌的大鼠HCC 组织^[20]及人类散在性结肠癌中分别发现了Cx32和 Cx43基因的特异性突变^[21]，但目前尚未有关于 Cx43基因在HCC中突变的报道。（2）Cx蛋白的 翻译后过程异常，如Cx蛋白磷酸化。研究表明， Cx43羧基末端为主要的磷酸化区，各种病理状态 下蛋白激酶C（PKC）、Src家族中酪氨酸激酶及 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）可以通过调节 Cx43羧基末端的磷酸化水平，导致Cx43介导的 信号转导异常^[22]。紧密连接蛋白ZO-1也能作用于 Cx43羧基末端而调节Cx的聚集，最终影响Cx43通 道的形成和功能^[23]。（3）Cx蛋白组装后向细胞膜 的转运受阻。Cx蛋白组装后向细胞膜转运路径不尽相同，如在HeLa细胞和心肌细胞中，Cx43蛋白 沿微管转运到细胞膜^[24]；在上皮细胞中，Cx43蛋 白沿肌动蛋白束转运到细胞膜^[25]。在转运的任一 环节发生错误，都会导致Cx蛋白不能正确转运到 细胞膜上。有研究发现，肿瘤细胞中常伴随Cx与 另一类连接蛋白如钙黏蛋白（E-cadherin）表达的 共同下调或异常定位^{[16, 26]}。而E-cadherin作为参与 上皮细胞间识别过程中的主要蛋白，它的异常可 导致细胞间的识别损伤，使组装后的Cx不能准确 定位到细胞膜上^[25]。但在本研究中，Cx43在HCC 组织或细胞胞质中的滞留机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究通过组织学和细胞学证据 一致证实HCC中存在Cx43蛋白表达和定位的异 常，表达数量的下调及蛋白的内化两者最终导致 细胞膜上有功能性的GJ形成下降，可能是HCC 发生的重要环节之一。针对肝细胞癌变后残存的 GJ，未来寻找或设计上调Cx43蛋白表达或逆转其 内化的方法或途径，以期改善HCC中GJ功能，可 能为肝癌临床治疗提供新思路及策略。