胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内其死亡率居第二位，是一种严重危害人类健康的疾病。虽然手术切除是胃癌治疗首选方案，但由于胃癌早期高转移，很多患者在诊断时已为中晚期，治疗常常很棘手^{[1, 2]}。探讨胃癌细胞侵袭和转移的机制，寻找新的治疗靶点对胃癌具有十分重要的意义。胃癌发生发展涉及一系列分子水平的异常，近年来研究发现迁移诱导基因7（migration inducing gene-7，Mig-7），能增加肿瘤细胞的侵袭能力从而促进肿瘤的转移^[3]。在前期研究中我们发现在胃癌组织中Mig-7高表达，与胃癌淋巴结转移呈正相关^{[4, 5]}。本研究在前期实验基础上，选用其中一条具有最佳干扰效果的靶向Mig-7基因的siRNA，通过抑制人胃癌MKN45细胞Mig-7基因的表达，观察其对胃癌细胞侵袭和迁移的影响，并探讨可能机制。

人胃癌MKN45细胞购自中科院上海细胞库；兔抗人Mig-7抗体为美国Abcam公司产品；兔抗人MMP-2和MMP-9抗体为美国Epitomics公司产品；引物由宝生物公司设计和合成。Lipofectamine^TM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司；Matrigel胶购自美国BD公司；Transwell小室为美国Corning公司产品。

靶向Mig-7基因的特异s iRNA序列为： 正义链5 ' -CUAUAGACUCUGAGCAAGAdTdT-3'，反义链3'-dTdTGAUAUCUGAGACUCGUUCU-5'。由广州市锐博生物科技有限公司合成。靶序列位于Mig-7重要功能区，经BLAST确认与人mRNA序列无同源性。（本实验中siRNA为化学合成，由广州市锐博生物科技有限公司合成，合成的siRNA成品为粉末状，研究者将其溶解在灭菌灭酶H₂O中，配制成20μmol/L储存液分装保存，按照转染说明书步骤直接进行后续转染）。

人胃癌MKN45细胞采用100 ml/L新生胎牛血清RPMI 1640培养液在37℃、5%CO₂条件下培养，转染前一天，将MKN45细胞传代于6孔板中培养，当细胞汇合度达30%~50%时，按Lipofectamine^TM2000 Reagent说明书进行转染，siRNA终浓度为50 nmol/L。转染后6~8 h更换含血清的完全培养液培养。

将实验分为三组，Mig-7-siRNA转染组、control-siRNA转染组及未转染MKN45组，分别提取各组转染后48 h细胞总RNA，总RNA进行反转录成cDNA，通过实时定量PCR扩增目的基因。反应体系为20 μl，其中Fast SYBR Green MixⅠ10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各0.8 μl，ddH₂O 6.4 μl。反应条件为：94℃预变性20 s，94℃变性5 s，60℃退火、延伸30 s，反应40个循环。采用2^-ΔΔCt法分析目的基因mRNA的相对表达水平。扩增基因的特异性引物序列为: GAPDH：正义引物：5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，反义引物：5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′；Mig-7：正义引物：5'-GACAAAGTCAAGAAGACAGACCGAG-3'，反义引物：5'-ATATTGTTGGATGGGATGTCTCG-3'。

实验分组同1.2.3。转染后72 h提取蛋白，测定浓度。各组相等的总蛋白量进行SDS-PAGE电泳分离后，电转至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭60~90 min。一抗Mig-7（1:500）、MMP-2、MMP-9（1:1 000）及β-actin（1:2 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜，分别室温孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（β-actin为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG）（1:2 000）2 h，TBST洗膜，化学发光（ECL）试剂盒显影。

实验分组同1.2.3，转染后48 h按细胞密度为1.5×10⁴/ml接种于96孔培养板中，每孔200 μl。每组设3个复孔，分别在接种后0、24、48、72 h，每孔加入MTT液20 μl，4 h后每孔加入200 μl二甲亚砜，酶标仪检测570 nm处吸光度值。以时间为横轴，A570nm值为纵轴，绘制生长曲线。

实验分组同1.2.3，转染后48 h按每孔8×10⁴个细胞接种于Transwell小室中，上室终体积为400 μl细胞悬液，下室为RPMI1640培养液600 μl。常规培养20 h，固定、瑞氏染色。倒置显微镜下观察并计数。

实验分组同1.2.3，实验前1天，Transwell小室上室面铺1:5 Matrigel胶，紫外灯照射过夜。转染后48 h按每孔8×10⁴个接种于Transwell小室中，上室终体积为400 μl细胞悬液，下室为RPMI1640培养液600 μl，常规培养30 h，固定、瑞氏染色。倒置显微镜下观察并计数。

采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，数据以（x±s）表示。P﹤0.05为差异有统计学意义。

转染后48 h,分别提取各组细胞的mRNA进行检测，验证其沉默效果，siRNA序列使Mig-7-siRNA转染组MKN45细胞中Mig-7在mRNA水平下降（80±2.91）%（P=0.000），转染阴性对照组siRNA后mRNA水平无明显改变（P=0.351）。转染后72 h，提取各组细胞的蛋白进行Westernblot检测，Mig-7蛋白相对表达强度各组分别为：（11.02±5.01）%，（146.56±0.96）%，（144.02±3.85）%。与未转染组及空白对照组比较Mig-7-siRNA转染组细胞中Mig-7蛋白水平下降（89.1±2.67）%（P=0.000），见图 1~2。说明靶点序列能有效降低MKN45细胞中Mig-7表达，保证后续的实验顺利进行。

*: P<0.05,compared with control-siRNA transfection and untransfection groups 图 1 转染后MKN45细胞Mig-7 mRNA的表达 Figure 1 Expression of Mig-7 mRNA in MKN45 cells after transfection

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1: Mig-7-siRNA transfection group; 2. control-siRNA transfection group; 3. untransfection group 图 2 转染后MKN45细胞Mig-7蛋白的表达 Figure 2 Expression of Mig-7 protein in MKN45 cells after transfection

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各时间观察点，转染组和空白转染组、转染组和未转染组、空白转染组和未转染组A570 nm的吸光度值比较，差异均无统计学意义[P=0.328,0.398,0.881（0 h），P=0.969,0.092,0.097（24 h），P=0.248,0.051,0.284（48 h），P=0.539,0.051,0.126（72 h），P>0.05]，转染后72 h内细胞增殖差异无统计学意义（P>0.05），见图 3。

图 3 各组胃癌细胞生长曲线 Figure 3 Growth curves of each group of gastric cancer cells

图选项

Mig-7-siRNA转染组20 h迁移细胞相对于control-siRNA转染组和未转染MKN45组明显减少（P=0.000），而control-siRNA转染组和未转染MKN45组之间差异无统计学意义（P=0.342），见图 4。Mig-7-siRNA转染组30 h穿过基底膜的细胞相对于control-siRNA转染组和未转染MKN45组亦有明显减少（P=0.000），而后两组差异没有统计学意义（P=0.251），见图 4。可见，由于Mig-7表达受抑制，胃癌MKN45细胞的迁移和侵袭能力受到不同程度抑制。

A: change of migration and invasion abilities of MKN45 cells after transfection(Wright’s staining ×200); B: cells number per field at high magnification; *: P<0.05,compared with control-siRNA transfection or untransfection groups 图 4 各组胃癌细胞迁移和侵袭能力 Figure 4 Migration and invasion abilities of each group of gastric cancer cells

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转染后72 h,Mig-7-siRNA转染组细胞MMP-2蛋白表达水平低于control-siRNA转染组与未转染组，差异具有统计学意义（P=0.000），而后两组该蛋白表达量差异没有统计学意义（P=0.777），转染组和空白转染组、转染组和未转染组、空白转染组和未转染组间MMP-9蛋白表达量差异无统计学意义（P=0.600,P=0137,P=0.064），见图 5，其中pro-MMP-2为MMP-2的前肽形式，active-MMP-2为MMP-2的活化状态。

A: the protein levels of MMP-2 and MMP-9 of each group; B: the relative protein quantitative of MMP-2 and MMP-9 of each group; 1: Mig-7-siRNA transfection group; 2. control-siRNA transfection group; 3. untransfection group; pro-MMP-2 was the propeptide form of MMP-2,active-MMP-2 was active form of MMP-2; *: P<0.05, compared with control-siRNA transfection or untransfection groups 图 5 转染后MKN45细胞MMP-2和MMP-9蛋白的表达 Figure 5 Protein expression of MMP-2 and MMP-9 in MKN45 cells after transfection

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肿瘤细胞的侵袭与迁移行为是恶性肿瘤的特征之一，亦是肿瘤发生转移最关键的因素。抑制肿瘤细胞的侵袭迁移、明确其机制，已成为研究的热点。而采取针对肿瘤细胞特异表达基因的靶向治疗，能发挥更有效的、不良反应更小的抗肿瘤治疗效果。

Crouch等^[6]发现了一种新的人类基因Mig-7，该基因位于1p22.1，其cDNA全长1 617 bp，编码产物为一富含半胱氨酸，由207个氨基酸组成的蛋白。前期研究已经证实从多种类型肿瘤组织细胞中检测到Mig-7表达，而在正常组织中未检测到其表达^[7]。抑制Mig-7表达，能降低子宫内膜癌、肺癌细胞的侵袭能力，而增加Mig-7表达，能增强结肠癌、肺癌细胞的侵袭能力^{[8, 9]}。此外，研究表明Mig-7与肿瘤的恶性程度密切相关，在高侵袭性的黑色素瘤细胞中表达，而在低侵袭性的黑色素瘤细胞中不表达^[3]。表明Mig-7在肿瘤的侵袭中起重要作用。结合其在肿瘤细胞中特异表达的特点，Mig-7可作为潜在的抗肿瘤靶点。

本研究采用化学合成的s i RNA下调胃癌MKN45细胞中Mig-7表达，观察了Mig-7水平降低对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。结果提示Mig-7-siRNA转染组较control-siRNA转染组及未转染组，细胞增殖无明显差异，而侵袭、迁移能力均显著下降，差异具有统计学意义。表明下调Mig-7表达对细胞增殖影响较小，但可明显降低胃癌MKN45细胞侵袭和迁移能力，与前期实验结果一致。在前期的研究中，我们测定了三种不同分化程度的胃癌细胞株SGC7901、MKN45、MKN28及正常胃黏膜GES-1细胞，观察到Mig-7在前2种细胞中表达，而在后2种细胞中不表达，且抑制SGC7901细胞中Mig-7表达后，也观察到该细胞侵袭及迁移能力受到抑制^[5]，以上实验结果表明Mig-7在胃癌细胞侵袭中起重要作用。

MMPs是一类可降低细胞外基质的蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs超家族的重要成员，能通过蛋白水解酶的作用降解间质结缔组织和基底膜成分，在肿瘤的侵袭转移中起重要作用^[10]。因此，本研究选取该两种蛋白作为观测指标，探讨Mig-7调节胃癌细胞侵袭迁移的可能机制。Petty等^[8]发现下调Mig-7表达能抑制MT1-MMP的活性，活化的MT1-MMP与MMP-2激活密切相关^{[11, 12]}。活化的MT1-MMP与MMP-2共同降解层黏连蛋白5γ2链为前迁移片段γ2′和γ2×片段，其中层黏连蛋白5γ2链是肿瘤侵袭转移所需的蛋白，当这些降解的片段释放到肿瘤微环境能增加侵袭和迁移^[3]。此外，AI-Raawi等^[13]研究表明MT1-MMP可能通过增加MMP-9表达在乳腺癌的进展中起重要作用。本研究观察到Mig-7-siRNA转染组中MMP-2蛋白水平较另外两组明显降低，且活化状态的MMP-2降低更明显，而各组MMP-9蛋白水平差异无统计学意义。由此推测，这可能与Mig-7作用通途有关，Mig-7的激活能促进下游MMP-2的活化，而抑制Mig-7的表达，导致活化状态的MMP-2受到抑制，进而导致层黏连蛋白5γ2 链水解减少，来调节胃癌细胞的侵袭能力，而与MMP-9蛋白无关。

综上所述，本研究证实了Mig-7在胃癌细胞侵 袭转移中发挥重要作用，抑制Mig-7表达可能对延 缓胃癌转移具有重要意义。