非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤^[1]。临床多数肺癌患者确诊时已属晚期，失去手术的最佳时机，所以预后较差。目前该病的治疗多采用手术、化疗、放疗、分子靶向治疗、免疫以及中医药等综合治疗方法。吉非替尼是EGFR-TKI类靶向治疗的代表性药物之一，多项Ⅲ期临床研究已经证实吉非替尼可以显著提高晚期NSCLC的有效率，延长无进展生存期和总生存期^{[2, 3, 4, 5, 6]}。鸦胆子油乳是近年来开发的由纯中药制成的抗肿瘤新药，临床上用于治疗肺癌、肺癌脑转移、消化道恶性肿瘤、膀胱癌、前列腺癌等^[7]。我们应用吉非替尼与鸦胆子油乳联合给药，观察其对肺腺癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡的影响，探索鸦胆子油乳可否对吉非替尼起到增效增敏的作用，为临床晚期肺癌患者的治疗提供新的思路。

人肺腺癌PC-9细胞株（EGFR突变型）由上海市肺科医院周彩存教授惠赠。人肺腺癌A549细胞株（EGFR野生型）由中国人民解放军第八一医院全军肿瘤中心实验科提供。吉非替尼（Gefitinib、IRESSA）购自阿斯利康公司（批号：HF025/1101073）；鸦胆子油乳注射液（Elemene）购自广州白云山明兴制药有限公司（批号：111002）；RPMI1640培养液、DMEM高糖培养液购自美国Thermo公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Amresco公司；TUNEL原位检测试剂盒（细胞）、细胞周期检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司；自动酶标读数仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson公司，型号为FACS Calibur。

将A549、PC-9细胞分别接种于RPMI1640培养液和DMEM高糖培养液中，培养液中各含10%胎牛血清、青霉素100 u/ml、链霉素100 μg/ml。两种细胞均置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱内培养，3~4天换液一次，约80%细胞贴壁即可传代。

取对数生长期的PC-9、A549细胞分别制成每毫升1.0×10⁵个以及每毫升5×10⁴个的细胞悬液，于96孔板每孔加入100 μl，然后置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。24 h后两种细胞培养板中都分别加入100 μl一定浓度梯度的吉非替尼和鸦胆子油乳溶液。吉非替尼作用PC-9细胞的浓度梯度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μmol/L，作用A549细胞的浓度梯度为0.5、1、2、4、8、16 μmol/L，两种细胞鸦胆子油乳的浓度梯度均为4、8、16、32、64、128 μg/ml。同时设无血清培养液、0.1%的DMSO溶液为对照组，每个浓度设3个复孔。经培养24、48、72 h后，实验组及对照组每孔加入20 μl已稀释的MTT，继续温育3 h，弃上清液，加入盐酸异丙醇（0.04 mmol/L）溶解，经振荡5 min后，用酶标仪在波长570 nm处测定各孔吸光度值（A₅₇₀）。实验重复3次以上。

计算吉非替尼、鸦胆子油乳单药作用于PC-9、A549细胞24、48、72 h的增殖抑制率。根据计算所得细胞抑制率作量效曲线，分析计算两种单药对PC-9、A549细胞24、48、72 h时的半数抑制浓度（IC₅₀）。

实验设联合用药组（G+ B ） 组，分别将PC-9、A549两种细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24 h后，计算吉非替尼和鸦胆子油乳两单药对PC-9、A549细胞作用72 h时的IC₅₀，选择0.25、0.5、1、2倍IC₅₀的药物浓度，按高低浓度剂量配比，同时加入两药。计算联合用药72 h后的细胞增殖抑制率。实验重复3次以上。

取对数生长期的PC-9、A549细胞分别制成每毫升1.0×10⁵个以及每毫升5×10⁴个的细胞悬液，于6孔细胞培养板（底部加洁净无菌盖玻片）中每孔加入1 ml细胞悬液，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24 h。按分组用药方案，每孔加入1 ml相应浓度的药物，并且设立无血清培养液为对照组，于培养箱中培养72 h。用PBS冲洗，自然风干后加入4%的多聚甲醛固定15~30 min，PBS漂洗。在盖玻片上滴加100 μl配制好的DNaseⅠ反应液处理10~30min，再次PBS漂洗。吸水纸吸干后在阳性样本上滴加50 μl TdT酶反应液，37℃避光反应60 min（阴性对照样本不加），PBS漂洗三次。滴加50 μl 配好的Streptavidin-FITC标记工作液，37℃避光反应30 min，PBS漂洗三次，每次5 min，注意避光。最后采用荧光显微镜检测：激发波长450~500 nm，发射波长515~565 nm。凋亡细胞可于荧光显微镜下见细胞核染成绿色，遂随机选取5个细胞分布均匀的视野，计数总细胞及凋亡细胞，计算凋亡指数（AI）。

取对数生长期的PC-9、A549细胞分别制成每毫升1.0×10⁵个以及每毫升5×10⁴个细胞悬液，取5 ml接种到细胞培养瓶，置于培养箱中6 h。待细胞贴壁后按实验分组加药5 ml培养。PBS清洗，处理细胞，取1 ml细胞悬液入离心管，将离心管以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。收集细胞，加入75%乙醇置于-20℃冰箱固定过夜，PBS清洗并加入50 μg/ml碘化丙啶（PI）和1 mg/ml RNaseA酶，避光染色30 min后通过流式细胞仪检测DNA含量，再运用计算机正态拟合分析细胞周期各时期（G0/G1期、S期和G2/M期）的分布比例。

采用统计学软件SPSS19.0对相关数据进行分析，所得数据以（x±s）表示，组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

采用MTT法测定细胞增殖抑制率，并进一步分析计算得出吉非替尼、鸦胆子油乳对两种细胞株的IC₅₀。结果显示，吉非替尼联合鸭胆子油乳（G+B组）处理PC-9细胞株后吉非替尼的IC₅₀为0.034 μmol/L，较吉非替尼单用时的IC₅₀（0.069μmol/L）下降了50.72%。G+B组处理A549细胞株后吉非替尼的IC₅₀为2.724 μmol/L，较吉非替尼单用时的IC₅₀（8.146 μmol/L）降低了66.56%。表明无论细胞株对于吉非替尼的敏感度如何，鸦胆子油乳与吉非替尼联合给药均可以明显增强吉非替尼对细胞的增殖抑制作用。

吉非替尼、鸦胆子单药作用于PC-9细胞株时，细胞凋亡率分别为（40±2.76）%和（27.02±1.53）%，而两者联合给药后，细胞的凋亡率增加到（73.07±2.70）%，组间差异有统计学意义（P=0.000）。凋亡细胞可于荧光显微镜下见细胞核染成绿色，见图 1B~D。对于A549细胞株，吉非替尼和鸦胆子单药组的细胞凋亡率分别为（21.12±1.46）%和（14.71±1.89）%，而联合给药组的细胞凋亡率明显升高至（60.78±2.51）%，各组差异有统计学意义（P=0.000），凋亡细胞见图 2B~D。2.3 吉非替尼联合鸦胆子油乳对PC-9、A549细胞周期的影响

A：control group; B: bruceolic oil emulsion group; C:gefitinib group;D: gefitinib combined with bruceolic oil emulsion group 图 1 吉非替尼和鸦胆子油乳对PC-9细胞诱导凋亡作用(Tunel×200) Figure 1 Effects of gefitinib and bruceolic oil emulsion on apoptosis of PC-9 cell line (Tunel×200)

图选项

A：control group; B: bruceolic oil emulsion group; C:gefitinib group;D: gefitinib combined with bruceolic oil emulsion group 图 2 吉非替尼和鸦胆子油乳对A549细胞诱导凋亡作用(Tunel×200) Figure 2 Effects of gefitinib and bruceolic oil emulsion on apoptosis of A549 cell line (Tunel×200)

图选项

由对照组细胞G0/G1、S、G2/M各期比例可见，PC-9、A549细胞均处于增殖旺盛期。与对照组比较，鸦胆子油乳组（B组）、吉非替尼组（G组）都是将PC-9、A549细胞阻滞于G0/G1期。两者联合用药后，两种细胞G0/G1期比例明显升高，差异有统计学意义（P=0.000），见表 1。

表 1 吉非替尼联合鸦胆子油乳对PC-9、A549细胞周期的影响 Table 1 Effects of gefitinib combined with bruceolic oil emulsion on cell cycles of PC-9 and A549 cell lines

表选项

中医药联合化疗或分子靶向治疗的综合治疗模式在临床的应用越来越广泛，中药除了可以减轻化疗药物对人体的不良反应外，还可以增加对化疗药物的敏感度甚至逆转耐药以加强化疗对肿瘤的杀伤效果，提升患者的依从性。单双双等^[8]在研究南方红豆杉水提物联合厄洛替尼抑制肺癌A549细胞的实验研究中发现，两药联合时通过下调细胞COX-2、MMP-2的表达，增强厄洛替尼对肺癌A549细胞的增殖抑制。张爱琴等^[9]通过实验发现β-榄香烯可以通过下调耐药细胞内P-gp、survivin表达水平逆转PC-9/ZD细胞对吉非替尼的耐药。

鸦胆子油乳是一种常见的抗肿瘤中药，临床用于各种肿瘤。从中药药性分析，鸦胆子具有清热、燥湿、杀虫和解毒的功效，而中医认为肿瘤系邪毒蕴结于经络脏腑，致阴阳失调、气血运行失常、脏腑功能失调等，因此鸦胆子具有一定的抗肿瘤作用^{[10, 11, 12, 13]}。临床随机对照研究证实，鸦胆子配合化疗及放疗都能起到增效减毒的作用。一项纳入86例晚期非小细胞肺癌患者的临床随机对照研究表明，鸦胆子油乳联合GP方案化疗与单用GP方案化疗的有效率分别为57.8%和36.6%，Ⅲ~Ⅳ度骨髓抑制发生率分别为22.2%和43.9%^[14]。此外，姚扬伟等学者的研究也得出了相似的结论^[15]。

本实验通过检测吉非替尼联合鸦胆子油乳对EGFR野生型A549及EGFR突变型PC-9肺腺癌细胞增殖抑制和凋亡效应，发现吉非替尼联合鸦胆子油乳对这两种细胞的增殖抑制效应均较单药明显增强，进一步计算分析得出两药呈现协同作用，与鸦胆子油乳联合给药后吉非替尼对PC-9和A549细胞的IC₅₀较单用时分别下降了50.72%和66.56%。我们试图从细胞周期角度对两者的协同效应加以解释，通过流式细胞仪检测发现吉非替尼和鸦胆子油乳均将细胞阻滞于G0/G1期，两药联合进一步促使了细胞凋亡。这一结果与杨洁等^[16]的研究发现一致，在鸦胆子油自微乳剂对肺癌A549细胞增殖抑制作用的实验中，也同样发现鸦胆子油自微乳剂随药物作用时间的延长，G₀/G₁期细胞比例升高，S期细胞逐渐减少。也有报道^[17]称鸦胆子油乳对癌细胞G₀、G₁、G₂、S、M期均有一定的杀伤和抑制作用，能抑制癌细胞DNA的合成，逆转耐药。从细胞周期的角度也许可以解释鸦胆子油乳联合吉非替尼的作用机制。

更有文献^[18]报道鸦胆子油乳可通过活化caspase-3诱导肺癌NCI-H460细胞凋亡，抑制细胞增殖。江波等^[19]通过观察鸦胆子油乳对非小细胞肺癌A549细胞诱导凋亡作用以及对细胞分泌血管内皮生长因子的抑制作用后发现，鸦胆子油乳通过诱导肿瘤细胞凋亡，减少肿瘤细胞分泌VEGF发挥其治疗肺癌的作用。但是目前还不清楚鸦胆子油乳对EGFR信号通路的影响，还需要从分子水平进一步研究。

综上，通过本实验研究可以看出，吉非替尼联合鸦胆子油乳能显著抑制腺癌PC-9、A549细胞增殖及诱导细胞凋亡，这可能与药物对细胞周期的阻滞作用有关，两者合用后鸦胆子油乳可对吉非替尼起到增效增敏的作用。