近年来，越来越多的研究发现肿瘤微环境因 子之一：微环境pH值在肿瘤的发生、发展、特别 是耐药方面具有不可忽视的作用 ^[1,2]。肿瘤组织的 pH值具有两个十分重要的特性：（1）反常性：细 胞的pH值分为细胞内pH值（intracellular pH,pHi） 和细胞外pH值（extracellular pH,pHe）两部分。 正常组织细胞的pHe值一般在7.4左右，pHi则略 低于pHe，为7.2左右。肿瘤细胞却相反，其pHi常 ≥7.4，pHe则较低，为6.5~7.0（最低可到6.0）。 因此恶性肿瘤细胞的pHe[1]。（2）广泛性： 肿瘤组织细胞内外的反常pH梯度主要与肿瘤细胞 的代谢特点相关，是广泛存在于各种肿瘤中的现 象，与病种、转移与否等均无明显关系^[2]。

肿瘤细胞体外培养时，培养液的pH值一般在 7.4左右。这一酸碱度和体内肿瘤微环境中的酸碱 度是不符合的。因此，在这一环境下培养的肿瘤 细胞并不能准确反映体内实际生长的肿瘤细胞情 况。本研究拟在符合肿瘤在体情况的pH值环境中 培养肿瘤细胞，观察其生长状况、细胞形态、细 胞凋亡情况、凋亡相关基因表达，探讨微环境外 pH值对肿瘤生长、形态、活力的影响。 1 材料与方法 1.1 实验材料

人大肠癌SW116、LoVo细胞，人胃癌MKN-28 细胞为南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心实 验室常规培养。新生牛血清（兰州民海生物）； MTT[溴化-3(4,5-二甲基-2-噻唑基-2,5-二苯基四 氮唑丁)]（Amersco,美国)；二甲基亚砜（上海 凌峰公司，分析纯浓度）；RPMI1640培养液 (Gibco，美国)。 Trizol Reagent（Invitrogen，CA， 美国）；反转录试剂盒ExScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time) （TaKaRa，日本）；荧光定量 PCR 试剂盒（ Ex Taq Q-PRC Mix：TaKaRa，日 本）；EASY Dilution（TaKaRa，日本）。其余试 剂均为国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及药物配制

将SW116、LoVo、 MKN-28细胞分别接种于含10%灭活小牛血清的 RPMI1640培养液中，置培养箱于5%CO₂、37℃充 分湿化条件下培养传代，取对数生长期细胞进行 实验。采用1M HCl及NaOH溶液调整细胞培养液 pH值(pHe)分别为6.8和7.4。 1.2.2 MTT法检测肿瘤细胞增殖活力

分别以每 孔5×10³的密度将3株细胞接种于96孔板内，培养 液为含10%小牛血清的RPMI1640，以NaOH及HCl 调节培养液pH值7.4及6.8。96孔板置37℃，含5% CO₂培养箱中全湿度培养48 h后，每孔加入1 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4 h后弃去上清液，每孔加 入200 μl二甲基亚砜，置振荡仪上充分混匀，采用 酶标仪以630 nm为参考波长，检测490 nm下吸光 度值，以pHe7.4环境下培养的细胞为对照，计算 pHe6.8环境下培养的细胞生存率，各组肿瘤细胞 抑制率按以下公式算。每组实验均重复3次以上。 细胞生存率=OD_实验孔/OD_对照孔×100%。 1.2.3 细胞形态观察

在光学显微镜下直接观察不 同pHe值下生长的肿瘤细胞的形态、生长密度等。 1.2.4 凋亡检测

采用Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystems,美国)试剂盒，按照说明书进行操作。 取对数生长期MKN-28细胞接种于6 cm培养皿中， 设定pHe7.4和pHe6.8两组。48 h后胰酶消化，收集 细胞，PBS洗2遍，100 μl结合缓冲液（4℃预冷） 重悬细胞，依次加入Annexin Ⅴ 5 μl和PI 1 μl，混 匀后室温避光孵育15 min后，加入400 μl结合缓冲 液，1 h内流式细胞仪检测分析各组细胞凋亡率。 1.2.5 凋亡相关基因Bcl-2及survivin表达的检测 1.2.5.1 细胞总RNA 提取 取在不同pH值培养液 中生长的细胞，收集肿瘤细胞。参照Trizol的说 明书提取细胞总RNA。主要步骤如下：(1) 每1× 10⁶个细胞加入1 mlTrizol，反复吹打至细胞完全裂 解；(2) 每管中加入0.2 ml氯仿，充分混匀后，4℃, 12 000 g离心15 min，吸取水相上层于另一EP管 中；(3) 于水相中加入0.5 ml 异丙醇，混匀后-20℃ 放置至少1 h，4℃,12 000 g离心10 min沉淀RNA； (4) 弃上清液，加入1 ml70%乙醇洗涤，4℃,7 500 g 离心5 min，弃上清液；(5) 重复一遍70%乙醇洗 涤，晾干；(6) 加入无RNase 水，60℃ 水浴5 min， 重溶RNA，取1 μl在核酸定量仪上定量后将剩余 RNA 反转录为cDNA，-20℃ 保存。 1.2.5.2 cDNA 合成

在冰上配制反转录反应液， 体系组成见表 1。反转录反应条件如下：42 ℃ 15 min；95 ℃ 2 min。cDNA 于-20℃ 保存。

表 1 RNA反转录反应体系 Table 1 Reagents for RNA reverse transcription

表选项

用EASY Dilution稀 释cDNA。在冰上配制PCR反应液20 μl（2× SYBR QPCR Mix 10 μl，10×primers 2 μl，cDNA2 μl， RNase Free dH₂O 6 μl）。实时 PCR循环参数：95℃ 预变性10 s，95℃ 变性5 s，60℃ 退火/延伸30 s， 45个循环。熔融曲线的循环参数：95℃ 1 min，从 55℃ 到95℃ 以0.1℃/s升温。所有样品均设三个复 孔，以提取的总RNA 为阴性对照。引物序列见表 2。以β-actin 作为内参，药物作用前细胞RNA作为 对照，根据公式2^-ΔΔCt计算药物作用前后目的基因 mRNA 表达的变化。

表 2 PCR引物序列 Table 2 Sequences of PCR primers

表选项

采用excel2003统计软件包进行统计学处理。 计量资料的处理采用t检验，P<0.05 定义为差异有 统计学意义。 2 结果 2.1 不同pHe值下细胞活力的变化

3种不同肿瘤细胞在pHe7.4及pHe6.8时的生长 情况，可以看出，与pHe7.4相比，在pHe6.8的环境 中，肿瘤细胞的生长更加旺盛，活力均较pHe7.4 时显著增加（P<0.05），见图 1。

*: P<0.05,vs. pHe7.4 图 1 不同pHe值下各肿瘤细胞的活力 Figure 1 Cell viabilities at different pHes

图选项

选取显微镜下观察MKN-28肿瘤细胞的两个 代表性视野，可以看出，与pHe7.4环境下生长的 MKN-28细胞相比，在pHe6.8的环境下，肿瘤细胞 的形态未发生明显变化，但细胞的密度较高。同 样，对于SW116及LoVo细胞，在pHe为6.8时，也 都出现了细胞密度增高，但形态均较pHe7.4时无 明显变化，见图 2。

图 2 MKN-28细胞在不同pHe值下的形态比较（×40） Figure 2 Morphological comparison of MKN-28 cells at different pHes （×40）

图选项

检测不同pH值下MKN-28细胞的凋亡率，可 以看出在pHe7.4及pHe6.8的环境下，细胞活力均良 好，未发生凋亡，见图 3。

图 3 不同pHe值下MKN-28细胞的凋亡情况 Figure 3 Apoptosis assay of MKN-28 cells at different pHes

图选项

检测pHe值对于凋亡相关基因Bcl-2及survivin 表达的影响。以pHe7.4的细胞为对照，检测pHe6.8 环境下细胞凋亡相关基因表达。当pHe从7.4下降 到6.8时，Bcl-2的表达显著性降低（P<0.05）， survivin的表达较pHe7.4时下降，但差异无统计学 意义（P>0.05），见图 4。

*: P<0.05,compared with pHe7.4 图 4 不同pH值下MKN-28细胞Bcl-2和survivin基因表达的 情况 Figure 4 survivin and Bcl-2 expression in MKN-28 cells at different pHs

图选项

作为一个重要的微环境因子，pH异常梯度是 恶性肿瘤的代谢特点所催生的^[3]。本实验结果可 以看出，低pHe可促进肿瘤细胞生长，图 1中的3 株肿瘤细胞的活力在pHe6.8环境中均较pHe7.4环 境中有明显增加。肿瘤细胞在生长速度加快的同 时，保持了良好的活力，形态上和pHe7.4时基本 相同。

本实验对于其中的MKN-28胃癌细胞做了更深 入的研究，发现在pHe6.8时，MKN-28细胞不仅保持 了良好的形态，也未发生凋亡。Matsuyama等^[4]研究 发现，Caspase的激活在pHe6.8左右是最有效的， 故酸性环境不仅是凋亡细胞的特性，亦为凋亡的 早期促发因素。肿瘤细胞通过维持较高的pHi，实 际上阻碍了细胞凋亡，使肿瘤细胞在旺盛生长的 同时，保持良好的活力。除此之外，细胞内较高 的pH值可以促进糖酵解，从而满足肿瘤细胞对于 能量的高需求，这也是导致低pHe时肿瘤细胞生长 旺盛的原因之一^[1,2]。

本实验还观察了凋亡相关基因Bcl-2及survivin 表达的变化，从图 4中可以看出，随着微环境pHe 的降低，Bcl-2的表达显著性降低，而survivin的表 达较pHe7.4时降低，但差异无统计学意义。Bcl-2 及survivin均为抗凋亡蛋白，Bcl-2是凋亡的最终 调控点，通过干扰细胞色素自线粒体的释放而阻 断蛋白酶级联反应的激活,survivin则在Bcl-2的下 游直接抑制细胞凋亡的核心—caspase而阻断肿瘤 细胞的凋亡^[5,6]。本实验中Bcl-2的表达水平降低， 可能是因为pHe6.8组中细胞的生长更为旺盛，从 而使凋亡相关蛋白酶的活性反馈性地增强（如 caspase-3），由于Bcl-2与Caspase-3为代表的凋亡 相关蛋白酶之间存在着密切关系，故其表达水平 发生变化^[7]。survivin由于是Bcl-2下游的蛋白，故 其活性未受到明显影响。

肿瘤细胞的低pHe和异常pH梯度对肿瘤的恶 性生物学行为具有重要的影响，除了促进肿瘤细 胞生长，亦有文献报道其可促进肿瘤的侵袭和转 移。对于化疗药物，也可导致pH依赖性生理性耐 药^[3,8]及导致放疗抵抗。传统的肿瘤基础研究中， 肿瘤细胞的生长环境pHe一般均为中性偏碱，即 pHe7.4左右，这个pHe值与健康人体的内环境pHe 值相似，但却并非肿瘤细胞在人体内生长繁殖时 的环境pHe。从本实验中可以看出，无论是pHe7.4 还是pHe6.8，肿瘤细胞的活力和形态并无明显差 异，提示传统的基于肿瘤细胞的科学研究结论有 一定的可靠性，但由于微环境的不同，pHe7.4环 境下肿瘤细胞的生长速度、某些基因的表达、对 药物的反应、生物学行为等会与pHe6.8环境下的 肿瘤细胞存在差异，这种差异也不可避免地导致 许多研究结果出现某种程度的偏差。因此，在关 于肿瘤的研究中，应当更加关注肿瘤细胞生长的 微环境因子，在实验设计上更加精细化，如调整 肿瘤细胞培养液的pH值，采用多层细胞培养模 型、肿瘤组织块培养模型等，使基础研究的结果 更具有实用价值和临床意义。