卵巢癌起病隐匿，死亡率位居妇科恶性肿瘤首 位。虽然手术及化疗方法不断改进和创新，卵巢癌 仍居妇女死亡原因的首位^[1]。这要求我们进一步研究 探索，寻找一个可以控制卵巢癌发生发展的方法。 Notch信号通路是一条高度保守的信号通路， Notch信号分子及其目的基因在细胞增殖、分化、凋 亡过程中有着重要作用^[2]。异常Notch信号通路与多 种恶性肿瘤的发生有关^[3,4]，Notch1在卵巢癌中有促 癌作用^[5]，并与卵巢癌组织分化程度相关^[6]，而γ-分 泌酶抑制剂可通过Notch信号通路抑制细胞生长、 诱导细胞凋亡^[7,8]。但γ-分泌酶抑制剂在卵巢癌细胞 中能否抑制Notch1信号通路，并抑制细胞生长、诱 导细胞死亡则有待进一步验证。因此，本研究的目 的就是验证γ-分泌酶抑制剂对Notch1的抑制能否引 起卵巢癌细胞生长抑制及凋亡。 1 材料与方法 1.1 细胞培养

将卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO-8910、 HO-8910PM及卵巢上皮细胞IOSE144培养于含10% 小牛血清（FCS）、青霉素（100 u/ml）、链霉素 （100 μg/ml）的RPMI1640培养液中，置于37℃、 5%CO₂培养箱内备用。每次实验均选用处于对数 生长期的细胞进行指标检测。 1.2 γ-分泌酶抑制剂处理

γ-分泌酶抑制剂（DAPT）用于阻断Notch1信号 通路。处于对数生长期、密度为每毫升1×10⁵ 个细 胞采用不同浓度DAPT（25、50、75 μmol/L）进行 处理，对照组用0.1%DMSO处理。在不同时间点检 测Notch1及hes1的表达，同时检测细胞生长、细胞 周期分布、细胞凋亡及克隆形成情况。 1.3 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)

四株卵巢癌细胞及一株卵巢上皮细胞IOSE144 细胞用Trizol裂解后按RNA提取方法提取细胞总 RNA，并用紫外分光光度计检测其浓度及纯度。 Notch1及β-actin引物均由TaKaRa公司设计合成。 Notch1上游引物：5’- TCA GCG GGA TCC ACT GTG AG-3’，下游引物：5’- ACA CAG GCA GGT GAA CGA GTT G-3’；hes1上游引物：5’-TGGAAA TGACAGTGAAGCACCTC-3’，下游引物：5’-TCG TTCATGCACTCGCTGAAG-3’；β-actin上游引物： 5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’，下游引物： 5’- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3’。 实时RT-PCR过程按照产品说明书操作，反转录条 件： 37℃水浴15 min，85℃ 5 s；RT-PCR反应条件： 95℃变性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸31 s。经ABI PRISM 7000所得的CT值用2^-△△Ct法分析处理。 1.4 Western blot 分析

所有卵巢细胞组织加入适量裂解液，所得 裂解液，于4℃下12 000 r/min离心10 min。取上 清液加入1/4体积的5×SDS蛋白加样缓冲液，煮 沸10 min。蛋白电泳及转膜：所得蛋白样品，经 3%SDS-PAGE分离后，电转至硝酸纤维素膜上， 丽春红染色验证蛋白转移成功。抗体杂交及显 色：以50 g/L的脱脂奶粉封闭2 h后，依次加入 Notch1羊多克隆抗体(室温2 h，TBS/T洗2次，TBS 洗1次)、兔抗羊二抗(室温2 h，TBS/T洗2次，TBS 洗1次)，最后加入NBT/BCIP底物显色。 1.5 MTT实验

取对数生长期的细胞调整密度为1×10⁵/ml悬 液，接种于96孔培养板内，每孔100 μl（1×10⁴个）。实 验组分别加入终浓度为25、50、75 μmol/L DAPT。 分别培养24、48、72 h后离心吸去上清液，每孔 加无血清培养液MTT（5 mg/ml）10 μl，37℃、 5%CO₂继续培养4 h后，终止培养，吸去上清液， 每孔加DMSO150 μl，充分振荡10 min，在酶联免 疫检测仪570 nm处测量吸光度(OD)值，与对照组 比较，计算各组细胞生长抑制率。实验重复3次取 平均值。 1.6 流式细胞术与细胞周期分析

取对数生长期细胞，调整密度为1×10⁵/ml， 接种于50 ml培养瓶，加入浓度分别为25、50、75 μmol/L DAPT，作用24 h后胰酶消化收集细胞，调 整待测细胞浓度为（5×10⁵～1×10⁶）/ml，缓慢加 入PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，1 000 r/min，离心 5 min，重复3次，将洗涤后的细胞加入1 ml PBS混 匀，再加入2 ml无水乙醇固定，固定1 h后用PBS洗 涤3次，将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4℃放 置30 min，放入FCM样本室，以激发波长488 nm测 定，并用modfit LTV2.0软件分析细胞周期。 1.7 凋亡实验

按照ELISA凋亡试剂盒说明步骤进行实验。 取样品离心后（1 000 r/min，10 min），吸取20 μl 上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中；另 加入80 μl免疫反应试剂，室温下孵育2 h（置摇床 上，250 r/min）；弃上清液，用300 μl温育缓冲液 洗涤3次，小心移去洗涤液；加入100 μl底物缓冲 液，室温下孵育至颜色变化至适合；然后作比色分 析，用底物缓冲液作空白对照，检测波长405 nm， 参考波长492 nm。 1.8 克隆形成实验

A2780细胞及DAPT处理组（5×10⁴/ml）按照 说明接种于6孔板内，置于含5%CO₂培养箱37℃孵 育14天，倒置显微镜下计数细胞克隆形成数。 1.9 统计学方法

SPSS14.0软件t检验对结果进行分析，采用均 数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Notch1及hes1在卵巢癌细胞A2780中的表达

实时定量PCR及Western blot结果发现五株卵巢 癌细胞中均有Notch1的表达，其中Notch1在A2780 和HO-8910细胞中的表达高于在IOSE144细胞中的表 达，见图 1A、1B；Notch1下游基因hes1在A2780细胞 中的表达明显高于在IOSE144细胞中的表达，见图 1C、1D。以上结果显示，Notch1及其下游hes1基因 在卵巢癌细胞A2780中高表达，因此选用A2780细胞 进行随后的实验。

A:mRNA expression of Notch1 in the five ovarian cell lines were measured by real-time RT-PCR;B:protein levels of Notch1 in the five ovarian cell lines were measured by Western blot;C:mRNA expression of hes1 in the five ovarian cell lines were measured by real-time RT-PCR;D:protein levels of hes1 in the five ovarian cell lines were measured by Western blot; *: P< 0.05,compared with IOSE144; a:A2780;b:8910;c:IOSE144; d: SKOV3;e:8910PM 图 1 Notch1和hes1在卵巢癌细胞A2780、SKOV3、HO-8910、HO-8910PM及卵巢上皮细胞IOSE144中的表达 Figure 1 Expression of Notch1 and hes1 in human ovarian cancer cell lines A2780,SKOV3,HO-8910 and HO-8910PM,and ovarian surface cell line IOSE144

图选项

不同浓度DAPT均能明显下调Notch1 mRNA的 表达，见图 2A；为了探讨Notch1转录水平的改变是 否引起翻译水平的变化，采用Western blot方法对 Notch1蛋白进行分析，结果证实DAPT可引起Notch1 蛋白的下调，见图 2B。这表明DAPT能抑制卵巢癌 细胞A2780 Notch1信号通路的表达，并呈剂量依赖 性。因此选用50 μmol/L浓度进行下面的实验。

A:Notch1 mRNA expression in ovarian cancer cells A2780 treated with different concentrations of DAPT;B:Western blot analysis showed that the protein levels of Notch1 were down-regulated in DAPT-treated A2780 in a dose-dependent manner;C:Notch1 mRNA expression in ovarian cancer cells A2780 treated with 50 μM/L DAPT for 6,12,18,24,48,and 72 h;D:After A2780 were treated with 50 μM/L DAPT for 24,48,and 72 h, Western blot analysis showed that the protein levels of Notch1 were down-regulated in a time-dependent manner. *: P < 0.05; * *: P < 0.01,compared with control group 图 2 DAPT对Notch1表达的影响 Figure 2 Effect of DAPT on Notch1 expression

图选项

随后采用50 μmol/L DAPT处理A2780细胞后 发现，Notch1 mRNA明显受到抑制并呈现时间依 赖性，见图 2C，Notch1蛋白表达也同样降低，见 图 2D。这些结果表明，DAPT能够抑制A2780细胞 Notch1信号通路，并呈时间依赖性。 2.3 DAPT对Notch1下游hes1基因表达的影响

采用实时定量PCR对DAPT处理A2780细胞的 mRNA进行检测，DAPT同样引起Notch1下游hes1 基因mRNA及蛋白的下调，并呈现剂量依赖性， 见图 3A、3B。

A:hes1 mRNA expression in ovarian cancer cells A2780 treated with different concentrations of DAPT; B:Western blot analysis showed that the protein levels of hes1 were down-regulated in DAPT-treated A2780 in a dose-dependent manner;C:hes1 mRNA expression in ovarian cancer cells A2780 treated with 50 μM/L DAPT for 6,12,18,24,48,and 72 h;D:After A2780 were treated with 50 μM/L DAPT for 24,48,and 72 h,Western blot analysis showed that the protein levels of hes1 were down-regulated in a time-dependent manner;*: P< 0.05; * *:P < 0.01,compared with control group 图 3 DAPT对hes1表达的影响 Figure 3 Effect of DAPT on hes1 expression

图选项

同样，采用50 μmol/LDAPT处理A2780细胞 后，发现Notch1下游hes1基因mRNA及蛋白也随时 间的不断延长表达逐渐降低，呈现时间依赖性， 见图 3C、3D。 2.4 DAPT下调Notch1表达后对A2780细胞生长的 作用及对细胞阻滞的诱导作用

采用不同浓度DAPT作用A2780细胞在不同时 间点进行分析，发现A2780细胞生长受到抑制并呈 时间和剂量依赖性，且在50 μmol/L、75 μmol/L时 抑制更显著，见图 4A。克隆形成实验也表明DAPT 处理组细胞克隆形成数明显低于实验组，见图 4B。 DAPT处理组细胞G₁期细胞比例增加、G₂期细胞比 例减少，细胞周期分析发现，A2780细胞G₁期阻滞 并呈剂量依赖性（P＜0.05），见图 4C~F。这些结果 都表明，DAPT下调Notch1可抑制A2780细胞生长并 诱导细胞G₁期阻滞。

A:After A2780 cells were treated with 25,50,and 75 μM DAPT for 3 d,MTT assay showed the cell growth was inhibited in a dose- and timedependent manner;B: After A2780 cells were treated with 50 μM DAPT for 14 d,colony formation assay showed the clonal growth of A2780 cells was significantly inhibited; C-F: effect of down-regulation of Notch1 on cell cycle distribution of A2780 detected by flow cytometry; C: Control group; D: 25 μM DAPT treatment group;E: 50 μM DAPT treatment group;F: 75 μM DAPT treatment group. Down-regulation of Notch1 caused G1 cell cycle arrest in a dose-dependent manner; *: P < 0.05; * *:P < 0.01,compared with control group 图 4 DAPT对卵巢癌细胞周期及细胞生物学的影响 Figure 4 Effect of DAPT on cell cycle and biology of ovarian cancer

图选项

采用50 μmol/L DAPT处理A2780细胞，在24、 48、72 h时间点进行检测发现，A2780细胞凋亡呈 现时间依赖性，且在48、72 h时凋亡数更多，见图 5。

DAPT-induced apoptosis in ovarian cancer cells A2780 was measured by ELISA. After treated with 50 μM/L DAPT for 24,48,or 72 h,the apoptosis of A2780 was induced in a time-dependent manner; *:P< 0.05; * *:P< 0.01， compared with control group 图 5 DAPT对卵巢癌细胞凋亡的影响 Figure 5 Effect of DAPT on the apoptosis of ovarian cancer cells

图选项

Notch信号通路在细胞生长过程中决定着细胞 命运，同时在许多恶性肿瘤发生发展、浸润及血管 形成过程中起着重要作用^[9,10,11]。Notch1的功能是癌 基因还是抑癌基因取决于细胞类型的不同，它在皮 肤癌和非小细胞型肺癌中起抑癌基因作用^[12,13]，而 在其他许多肿瘤中起癌基因作用，如：肾癌、胰 腺癌、乳腺癌和前列腺癌等^[14]。Notch1在妇科宫 颈癌中也起癌基因作用，其影响细胞生长分化的 下游基因hes1在宫颈癌细胞系中有高表达^[5]。我们 先前的研究^[6]发现Notch1在卵巢癌中的表达与卵巢 癌组织分化程度相关。本实验研究了Notch1在卵 巢癌细胞A2780增殖及凋亡过程中的作用，发现下 调Notch1能抑制A2780生长并诱导凋亡，进一步证 明Notch1在卵巢癌中起到癌基因的作用。

hes1是Notch信号通路下游、影响细胞增殖及 分化的靶基因^[15,16,17]。本研究发现在A2780细胞中 DAPT下调Notch1能下调其下游hes1基因的表达， 并呈现时间和剂量依赖性；下调Notch1能引起 A2780细胞生长抑制、细胞克隆数减少，同时引起 细胞G₁期阻滞；还能引起A2780细胞凋亡，并呈 时间依赖性。然而，Notch信号通路介导的、影响 A2780细胞生长分化的下游基因的分子过程还不是 十分清楚，也许hes1只是Notch信号通路下游众多 功能性靶基因中的一个，其功能的完成需要Notch 信号通路下游的其他靶基因的共同完成。在卵巢 癌中，Notch信号通路及其下游基因的功能还不 是完全清楚，因此，需要更多的实验进一步阐明 Notch信号通路与卵巢癌发生发展分子机制之间的 关系。

γ-分泌酶是Notch信号胞内段NICD释放的一个 关键蛋白^[3]，γ-分泌酶抑制剂可阻断Notch信号胞 内段的释放并抑制Notch信号通路的激活^[18]。研究 报道，γ-分泌酶抑制剂已经运用于Notch激活引起 的相关疾病，如γ-分泌酶抑制剂可用于Alzheimer’s 疾病的治疗^[19]；γ-分泌酶抑制剂在非白血病性白血 病治疗中不良反应小、安全性更高^[20]；在急性淋 巴细胞性白血病（T-ALL）有治疗作用^[21]，且与糖 皮质激素联合用药还可以降低其毒性等^[22]。许多 研究认为，有Notch信号通路开关作用的γ-分泌酶是 Notch通路钝化的最佳靶点。最近，γ-分泌酶抑制剂 与肿瘤基因治疗的研究已成研究热点，因为它可能 是Notch激活相关肿瘤的一个新的治疗靶点^[23]。本 研究中，γ-分泌酶抑制剂DAPT有效抑制了Notch1 及其下游hes1基因，同时抑制了A2780细胞增殖并 诱导细胞凋亡。然而，在动物实验或临床试验中 是否有这样的结果呢？更多的研究还将继续。随 着对Notch信号通路与卵巢癌发生机制、相关癌基 因和抑癌基因关系的不断深入研究，γ-分泌酶抑制 剂可能成为卵巢癌治疗的一个新靶点。