我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家， 新疆是我国食管癌高发区之一，而在新疆居住的 13个民族中哈族食管癌的发病率（155.9/10万）^[1] 和死亡率（68.88/10万）^[2]均高于其他民族。目前 认为哈族食管鳞癌的高发主要与其特殊的饮食生 活习惯如大量饮酒、喝热奶茶、酸奶疙瘩、饮食 快、饮食粗糙等相关^[3]。

smad4基因是由Hahn发现的^[4]，该基因是定位 于胰腺癌染色体18q21.1上的一种抑癌基因。抑癌 基因启动子区CPG岛发生高甲基化是基因失活的 重要机制，而基因失活可导致肿瘤的发生^[5]。 1 资料和方法 1.1 临床资料

组织标本来源于2009年1月—2011年12月新疆 哈萨克自治州新源县人民医院就诊的食管癌患者， 由新疆石河子大学医学院第一附属医院经内镜病 理诊断为食管鳞癌，其中哈族食管鳞癌和正常食 管组织分别为37和33例；汉族食管鳞癌和汉族正常 食管组织分别为31和33例。所有患者均未行放 、 化疗和手术治疗。其中男66例，女68例，年龄分布 30~80岁，中位年龄55岁。组织学分级高、中、低 分化食管鳞癌分别为21、25、22例。 1.2 方法 1.2.1 引物设计

内参β-actin引物由上海生工生物 有限公司设计合成，甲基化引物使用Sequenom公 司Epidesigner设计软件对smad4基因启动子区CpG 片段扫描、设计引物。引物扩增片段为320bp，见 表 1。引物序列用PCR扩增，在正向引物5’端加入 10mertag，用于平衡PCR反应条件；反向引物5’端 加入T7-Promoter 序列，用于后续的体外转录。

表 1(Table 1)

表 1 smad4基因甲基化引物序列 Table 1 The primer sequences of smad4 gene methylation

表 1 smad4基因甲基化引物序列 Table 1 The primer sequences of smad4 gene methylation

取50 mg组织标本，研磨成粉末 状，加入裂解液、蛋白酶K等，56℃过夜，第二天用 QIAGENDNA提取试剂盒提取DNA并收集约50μg DNA样本，内参β-actin用于检测DNA，所有DNA应 用分光光度计定量，电泳主带明显没有降解，浓度 高于75ng/μl，总量不小于2μg，A260/A280=1.7~2.1，质 检合格DNA样本于-20℃冰箱保存，见图 1。

1-8:esophageal squamous cell carcinoma tissues of the Kazaks 图1 哈萨克族食管癌组织中DNA提取 Figure 1 DNA extraction from the ESCC tissues of the Kazaks

DNA样 本亚硫酸处理应用EZDNAMethylation-GoldKit， ZYMO试剂盒,PCR扩增应用PCR Accessory Set试 剂盒，将5'-primer-(T7)primer混合成primerMAX使 用，终浓度为1μmol/L。 1.2.4 碱性磷酸酶处理及体外转录、RNase酶切、 纯化、点样及质谱分析

应用MassCLEAVEKit 试剂盒对样本进行碱性磷酸酶处理及体外转录 和RNase酶切。应用MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪将纯化后的产物点至3 8 4格式 的Spectr oCHI P芯片上，最后将芯片放入Mass ARRAY Compact System进行检测。SpectroCHIP芯 片使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸附电离飞行 时间质谱分析技术，通过EpiTYPER软件完成数据 分析。 1.3 统计学方法

应用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析， 两独立样本Wilcoxon秩和检验对两样本间甲基化 率进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 食管癌组织smad4基因启动子区总体平均甲基 化率的比较

汉族食管癌组和对照组、哈族食管癌组和对 照组中smad4基因启动子区平均甲基化率分别为 3.4%和2.8%(P=0.488)、3.4%和2.5%(P=0.271)，差 异均无统计学意义。 2.2 食管癌组织smad4基因启动子区不同CPG位点甲基化率比较

smad4基因启动子区CpG-15、CpG-27的平 均甲基化率在汉族食管癌中（4.7%、4.9%）明 显高于正常对照组（2.8%、3.5%）（P=0.018、 0.045）；CpG- 1、CpG- 16- 19、CpG- 27- 28、 C p G - 3 1 - 3 3在哈族食管癌中的平均甲基化率 （1.7%、4.5%、4.9%、6.8%）明显高于正常对照组的（0.7%、2.2%、3.0%、5.5%）（P=0.028、 0.001、0.007、0.012），CpG-6在哈族食管癌中 的平均甲基化水平（1.9%）明显高于汉族食管癌 （0.4%）（P=0.000）；CpG-14在哈族正常组织 中的平均甲基化水平（6.2%）与在汉族正常组织 中的甲基化水平也有差异（7.3%）(P=0.021)； CpG- 6、CpG- 15、CpG- 16- 19、CpG- 27- 28、 Cp G- 3 1 - 3 3在哈族正常组织中的平均甲基化率 （1.1%、3.1%、2.2%、3.1%、5.5%）与在汉族食 管癌组织中的平均甲基化率的差异（0.4%、4.8%、 4.1%、4.9%、7.6%）也有统计学意义（P=0.035、 0.025、0.006、0.004、0.025），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 哈萨克族和汉族病例SMAD4基因CpG片段甲基化水平的Wilcoxon W秩和检验 Table 2 Wilcoxon W rank-sum test of methylation levels of CPG sites in smad4 gene in the Kazaks and the Hans Notes:NESE:normal esophageal squamous epithelium

表 2 哈萨克族和汉族病例SMAD4基因CpG片段甲基化水平的Wilcoxon W秩和检验 Table 2 Wilcoxon W rank-sum test of methylation levels of CPG sites in smad4 gene in the Kazaks and the Hans

smad4基因在汉族、哈族食管鳞癌组织中的不 同的分化程度的平均甲基化率的差异有统计学意 义，且随分化程度增高甲基化率降低。但smad4基 因在汉族、哈族食管癌组织不同性别中的甲基化 率的差别没有统计学意义，见表 3~4。

表 3(Table 3)

表 3 食管癌患者smad4基因启动子区总甲基化率在不同分化程度之间的差异 Table 3 Differences of total methylation rates of smad4 gene promoters at different differentiated degrees in esophageal cancer patients Notes:rank-sum test of independent samples of three groups;ESCC: esophageal squamous cell carcinoma

表 3 食管癌患者smad4基因启动子区总甲基化率在不同分化程度之间的差异 Table 3 Differences of total methylation rates of smad4 gene promoters at different differentiated degrees in esophageal cancer patients

表 4(Table 4)

表 4 食管癌患者smad4基因启动子区总甲基化率在不同性别之间的差异 Table 4 Differences of total methylation rates of smad4 gene promoters in different gender of esophageal cancer patient Notes:rank sum test of two independent samples

表 4 食管癌患者smad4基因启动子区总甲基化率在不同性别之间的差异 Table 4 Differences of total methylation rates of smad4 gene promoters in different gender of esophageal cancer patients

遗传学和表观遗传学的改变是影响肿瘤形成 的两大机制，DNA甲基化是一种重要的表观遗传 学现象。DNA启动子区高甲基化存在于多种肿 瘤中，可作为肿瘤诊断、预防、治疗、预后判断 的指标^[6,7,8]。在食管鳞癌中也存在多种基因的异常 甲基化，如P16、MGMT、Hmlh1、RASSF1A、 hMSH2、RIZ1 ^[9,10,11]等，均说明基因异常甲基化与 食管癌的发生有关。转化生长因子β（TGF-β）在 细胞的生长、增殖、分化、凋亡、基质产生、肿 瘤形成等过程中均起着重要的作用，TGF-β/smad 信号传导通路能通过抑制肿瘤细胞增殖从而抑制 肿瘤的发生、发展^[12]，smad4基因表达产物smad4 蛋白是TGF-β/smad信号传导通路中的组成成分， smad4基因缺失或突变可引起肿瘤细胞逃避TGF-β 对肿瘤细胞增殖的抑制作用引起肿瘤的发生^[13]。

本实验采用MassARRAY甲基化DNA定量分 析技术检测食管鳞癌组织中smad4基因的甲基化水 平，共分析了33个CpG位点，12个CpG单位。试验 结果中汉族食管癌组和对照组、哈族食管癌组和 对照组中smad4基因启动子区CpG位点的平均甲基 化率的差异不明显，但总体甲基化率之间的差异对试验结论的影响较小，总体中存在每个位点的甲 基化率，试验中研究的是个别位点的甲基化率。郭 炜^[14]和董稚明^[15]等分别对汉族贲门腺癌和食管鳞癌中 smad4基因甲基化状态进行分析，发现smad4基因在启 动子区发生了高甲基化并使smad4基因沉默，导致肿 瘤的发生，这与本试验结果相近。

汉族食管癌组织中smad4基因启动子区CpG-15、CpG-27的平均甲基化率（4.7%、4.9%） 明显高于对照组（2.8%、3.5%），表明这两个位点 的高甲基化可能与汉族食管鳞癌的发生有关,可以 作为汉族食管鳞癌的诊断标志物，可通过大样本 试验来判断其对汉族食管癌诊断的意义；CpG-1、 CpG-16-19、CpG-27-28、CpG-31-33的平均甲基化 率在哈族食管癌组（1.7%、4.5%、4.9%、6.8%） 明显高于哈族正常对照组（0.7%、2.2%、3.0%、 5.5%），故这四个位点的高甲基化可能参与了哈 族食管癌的发生；CpG-6在哈族食管癌和哈族正 常组织中的平均甲基化水平(1.9%,1.1%)均明显高 于汉族食管癌组(0.4%)，CpG-15、CpG-16-19、 CpG-27-28、CpG-31-33的平均甲基化率在哈族对照 组（3.1%、2.2%、3.1%、5.5%）与在汉族食管癌组 （4.8%、4.1%、4.9%、7.6%）的差异也有统计学意 义。故CpG-6的高甲基化可能参与了哈族食管癌的 发生，是哈族食管鳞癌的高危因素，可能是哈族较 汉族食管鳞癌高发的关键性原因之一。因为哈族食 管鳞癌高发，那么理论上就可能会存在某个CpG位 点的甲基化率在哈族食管鳞癌组或哈族对照组中较 在汉族食管组织中高，本试验中发现的CpG-6很可 能是哈族smad4基因特异的高甲基化位点之一，这一 发现若得到证实将对哈族食管癌患者有重要意义。

smad4基因在汉族、哈族食管鳞癌组织中不同 分化程度的平均甲基化率差异有统计学意义，且随 分化程度增高甲基化率降低；smad4基因在汉族、 哈族食管癌不同性别中甲基化率差别没有统计学意 义。故smad4基因启动子区高甲基化不仅参与了食 管鳞癌的发生，还可能与食管鳞癌的发展有关系， 可作为食管鳞癌诊断及治疗的指标。由于试验时间 有限，目前随访工作正在进行，smad4基因是否可 以作为食管鳞癌预后监测的指标尚需继续验证。

研究发现甲基化是可逆的，因此应用去甲基化 剂来抑制癌细胞的增殖成为治疗食管鳞癌的新方 法。CpG-6对哈族食管鳞癌高发的原因研究中有重 要意义，需进一步探索研究。随着对肿瘤抑制基因 启动子区甲基化研究的深入，找到与食管鳞癌密切 相关的基因对食管鳞癌患者的预防、诊治、指导放 化疗及新药的开发等方面均有很大意义。