近年来 ，我国恶性淋巴瘤的发病率不断增长，多种亚型的淋巴瘤患者5年生存率不足 50%^[1]。除了化疗、单克隆抗体治疗外，基因治疗 也是目前淋巴瘤治疗的研究热点之一。尽管肿瘤 的基因治疗取得了许多成果，但仍然面临许多的 问题与挑战，其中最主要的问题是目的基因靶向 性较差与表达效率较低。本课题组前期研究已证 实survivin启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异 性^[2]，很大程度上解决了肿瘤基因治疗的靶向性 问题，但是相对于通常使用的巨细胞病毒启动子 (CMV)而言，survivin启动子的活性较弱，目的基 因表达量不能满足临床治疗需要。

研究资料显示二步转录放大系统（two-step transcriptional amplification，TSTA）和土拨鼠肝 炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）能 通过不同方式增强目的基因表达。TSTA系统是一 种嵌合型转录因子，由酵母GAL4-DNA结合域、 Ⅰ型单纯疱疹病毒即刻早期反式作用因子VP16激 活结构域及含有5个GAL4结合域和E4TATA盒的 启动元件G5E4T组成^[3]。WPRE是一种基因转录 后调控因子。应用基因重组技术构建的含VP16-GAL4与WPRE的整合型系统性基因表达信号扩增 器(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier, VISA)可以大幅提高目的基因的表达效率。本研 究中我们拟构建survivin启动子与WPRE、TSTA和 VISA系统分别构成的表达质粒，通过比较淋巴瘤 细胞转染后的荧光素酶表达水平，选择在淋巴瘤 细胞中具有较高表达效率的信号放大系统，为进 一步研究淋巴瘤基因治疗奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒

pGL3-Survivin质粒由本科室唐友红博士 惠赠^[2]，pCMVgDWPRE质粒由意大利帕尔马大学Dr Gaetano Donofrio惠赠^[4]，TSTA-NSN质粒由美国加州 大学洛杉矶分校医学院Dr Mike Carey惠赠^[5]，pGL3-CMV、pGL3-Basic质粒购自Promega公司。 1.1.2 细胞

人淋巴瘤Ramos、U937、 Raji细胞 株购自上海麦莎生物科技有限公司，人肝细胞株 Chang Liver购自中科院上海生命科学院细胞所。 1.1.3 试剂

实验所用内切酶均为N E B( N e w England Biolabs公司)产品，连接酶（宝灵曼B.M公 司）,DNA连接酶、luciferase assay system试剂盒、 TD-20/20荧光检测计（Promega公司）。新生小牛 血清(杭州四季青生物公司)，DMEM、RPMI 1640 培养液(美国Gibco公司)，质量小量提取试剂盒(美 国Omega公司)、胶回收试剂盒(TaKaRa公司)， Lipofectamine 2000脂质体购自Invitrogen公司。 1.2 方法 1.2.1 WPRE基因扩增

根据pCMVgDWPRE质粒 序列设计WPRE上下游引物，由上海英骏生物技术 有限公司合成。上游引物序列为：5'-TGTCTAGAATCAACCTCTGGATTAC-3’，下游引物序列为： 5'-CATCTAGACCAGGCGGGGAGGCGGC-3’， 上、下游引物5'端带有Xba Ⅰ酶切位点（用下划线 标示）。以pCMVgWPRE质粒为模板扩增WPRE 基因，PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s， 55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 8 min。 反应结束后，取PCR产物5 μl电泳，并送上海生工 生物工程技术服务有限公司作DNA测序。 1.2.2 pGL3-Survivin-WPRE（S-WPRE）载体构 建

WPRE基因PCR产物经XbaⅠ酶切、纯化后， 应用T4 DNA连接酶与pGL3-Survivin载体经Xba Ⅰ 酶切、纯化后的产物进行连接，构建成S-WPRE载 体，经PCR及XbaⅠ酶切鉴定并送上海英骏生物技 术有限公司纯化测序。 1.2.3 pGL3-Survivin-TSTA（S-TSTA）载体的构 建

KpnⅠ和NheⅠ双酶切TSTA-NSN和pGL3-survivin质粒，回收约6 000 bp的TSTA载体片段和 约1 000 bp的survivin启动子片段，用T4 DNA连接 酶连接，构建成S-TSTA载体，利用PCR及双酶切 （KpnⅠ/NheⅠ）鉴定。 1.2.4 pGL3-survivin- VISA（S-VISA）载体构 建

（1）pGL3-G5E4T-WPRE载体的构建：根据 TSTA-NSN质粒序列设计G5E4T片段上下游引物， 由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序 列为：5'-TGGGTACCTGCCTGCAGGTCCGGAG-3’，下游引物序列为：5'-GGTCGACTTACTTAGATCGCAGATT-3’，上下游引物5'端分别带有Kpn Ⅰ、SalⅠ酶切位点（用下划线标识）。以TSTANSN为模板扩增G5E4T。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，53.5℃ 30 s，72℃ 30s 30个循 环，72℃ 8 min。反应结束后，取PCR产物5 μl电 泳分析结果。 KpnⅠ和SalⅠ双酶切G5E4T片段 PCR产物，连入KpnⅠ和XhoⅠ双酶切的S-WPRE 载体（SalⅠ酶切后的末端可以和XhoⅠ酶切后的 末端钝性连接）构建成pGL3-G5E4T-WPRE过渡载 体。利用KpnⅠ及HindⅢ酶切鉴定（因钝性连接 后XhoⅠ已被破坏）。（2） S-VISA载体的构建: KpnⅠ和SalⅠ双酶切pGL3-S-TSTA和pGL3-G5E4TWPRE载体，回收约4 800 bp的S-TSTA片段（保留 了survivin启动子、除G5E4T外的TSTA系统和部分 载体序列）和约2 800 bp的G5E4T-WPRE片段（保 留了G5E4T、荧光素酶编码基因、WPRE和poly A 序列）。用T4 DNA连接酶连接，构建成S-VISA载 体。利用PCR及双酶切（KpnⅠ/SalⅠ）鉴定。 1.2.5 质粒转染与荧光素酶检测

取对数生长期 的Ramos细胞及Chang Liver细胞，用脂质体法分别 瞬时转染重组质粒pGL3-CMV (阳性对照组)、pGL3-survivin /S-WPRE/S-TSTA/S-VISA(实验组)和pGL3-basic(阴性对照组)，转染方法按照Lipof ectamine 2000操作说明进行。48 h按照luciferase assay system试剂盒的步骤进行细胞裂解液制备，并用TD-20/20 荧光检测计进行荧光素酶检测。 1.3 统计学方法

本实验中所有数据均采用均数±标准差（x±s） 表示。应用SPSS16.0软件，各组数据进行分析比 较，以α=0.05为检验标准。多组间比较采用OneWay ANOVA检验，多个样本均数间两两比较采用 S-N-Kq检验法，相关分析采用直相关计算Pearson 相关系数，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 WPRE序列测序结果

以pCMVgWPRE质粒为模板扩增WPRE基因， 扩增产物进行测序，所得序列结果（图略）与 GenBank报道的完全一致。 2.2 重组载体的鉴定

重组载体S-WPRE、S-TSTA及S-VISA的酶切鉴定, 见图 1~3。同时测序结果显示S-WPRE载体构建成功。

S-WPRE:pGL3-survivin-WPRE; Lane1: S-WPRE vector digested by XbaⅠ; M:MBI DNA ladder SM0331 图1 重组载体S-WPRE酶切鉴定图 Figure 1 Rest rict ion enzyme digest ion analysis of recombinant vector S-WPRE

S-TSTA: pGL3-survivin-TSTA; Lane1: S-TSTA vector digested by KpnⅠ and NheⅠ; M: MBI DNA ladder SM0331 图2 重组载体S-TSTA酶切鉴定图 Figure 2 Rest rict ion enzyme digest ion analysis of recombinant vector S-TSTA

S-VISA: pGL3-survivin-VISA; Lane1: S-VISA vector digested by Kpn Ⅰand NheⅠ; M: MBI DNA ladder SM0331 图3 重组载体S-VISA酶切鉴定图 Figure 3 Rest rict ion enzyme digest ion analysis of recombinantvector S-VISA

以pGL3-CMV为阳性对照(100％)，pGL3-Basic 为阴性对照，荧光素酶检测结果，见表 1。转染 S-WPRE后Ramos、U937、Raji及chang liver细胞的 荧光素酶表达水平均明显低于转染pGL3-CMV细 胞（P<0.01）；转染S-TSTA、S-VISA后Ramos、 U937、Raji细胞的荧光素酶表达水平均高于转染 pGL3-CMV细胞（P<0.01），而Chang Liver细胞中 的表达水平低于转染pGL3-CMV细胞（P<0.01）。 转染S - VSIA后Ramos、U937、Raji细胞 中的荧光素酶表达水平高于转染S - TSTA细胞 （P<0.05），而在Chang Liver细胞中表达水平差 异无统计学意义（P>0.05）。

表 1(Table 1)

表 1 S-VISA、S-TSTA、S-WPRE及pGL3-CMV在不同细胞中的荧光素酶活性 Table 1 The luciferase activities of recombinant vectors S-VISA, S-TSTA, S-WPRE and pGL3-CMV in different cells

表 1 S-VISA、S-TSTA、S-WPRE及pGL3-CMV在不同细胞中的荧光素酶活性 Table 1 The luciferase activities of recombinant vectors S-VISA, S-TSTA, S-WPRE and pGL3-CMV in different cells

目前应用于淋巴瘤基因治疗的目的基因表达 量较低，不能满足治疗基因高水平表达的需求。 因此，提高目的基因在淋巴瘤细胞中的表达水平 成为进一步临床应用必需要解决的问题。

目的基因表达要经过基因激活、转录、翻译等 多个阶段，这些阶段受到多种调节因素影响。组织 特异性启动子能驱动转录因子VP16-GAL4，增强下 游目的基因表达，VP16-GAL4增强的转录信号通过 与G5E4T结合而再次放大，进一步提高目的基因表 达水平。Iyer等^[6]在前列腺癌LNCaP细胞系中应用 TSTA系统来增强前列腺特异性抗原启动子的转录 活性，驱动荧光素酶基因及突变型Ⅰ型单纯疱疹病 毒（herpes simplex virus，HSV1）胸苷激酶（HSV1-sr39tk）基因，结果显示荧光素酶活性提高了约50 倍，HSV1-sr39tk活性提高了约12倍。Song等^[7]研究表 明，含人端粒酶反转录酶启动子(human telomerase reverse transcriptase promoter，hTERTp)与TSTA的 重组质粒能使hTERTp在hTERTp阳性卵巢癌细胞中 的转录活性提高200倍左右，进而促进靶基因表达增强。本研究结果也证实TSTA系统促进了淋巴瘤 Ramos、Raji、U937细胞中的荧光素酶表达，其表达 水平高于转染pGL3-CMV的细胞。

WPRE是一种转录后调控因子，将其插入目的 基因下游可以增强目的基因mRNA转录后蛋白的 翻译，增加目的基因编码蛋白的表达量。Sims等^[8] 在鼠神经细胞中将WPRE插入目的基因下游，实 验结果显示目的基因编码蛋白表达量提高了8倍。 Mariati等^[9]研究证实WPRE在人胚肾HEK293细胞 中的转录后调控作用。本研究结果显示单独转染 WPRE促进荧光素酶表达的能力弱于CMV启动子。

Xie等^[10]利用TSTA和WPRE构建出VISA系统 表达载体，以胆囊收缩素A受体（CCKAR）启动 子作为胰腺癌特异性启动子介导荧光素酶报告基 因转染胰腺癌细胞及正常胰腺导管上皮细胞，结 果显示，使用C-VISA作为基因表达载体驱动报告 基因表达的效率明显高于使用C-TSTA及单独使用 CCKAR启动子。Sher等^[11]在肺癌基因治疗研究中 发现，在鼠肺癌TC-1细胞中联合了VISA系统的 survivin启动子活性持续性增强，S-VISA的启动子 活性比单独的survivin启动子提高了17倍，并且其 促进目的基因表达的效率明显高于CMV启动子。 卵巢癌基因治疗研究中得出类似的结论^[12]。本研 究也发现S-VISA能促进荧光素酶表达，且效率高 于CMV启动子，与前述研究结果一致。

在本研究中，我们成功构建了S - WP R E、 S-TSTA及S-VISA表达质粒，以其转染淋巴瘤细胞， 荧光素酶检测结果表明，相对于CMV、S-WPRE和 S-TSTA，S-VISA在淋巴瘤细胞Ramos、U937、Raji 中驱动荧光素酶表达具有明显的优势，同时保持了 survivin启动子的淋巴瘤特异性，证实了Survivin启 动子和VISA放大系统的联合可以作为一种淋巴瘤 特异性高效基因表达载体，为进一步研究淋巴瘤基 因治疗提供了良好的实验依据和新的思路。