膀胱移行细胞癌（bladder transitional cell carcinoma,BTCC）是泌尿系统最常见的恶性肿 瘤，具有复发率高的临床特点。植物多酚紫铆因 (Butein)具有抗炎、抗纤维化、抗癌等作用，还是NF-κB通路的有效抑制剂。NF-κB在膀胱癌中常表 现为组成性激活。天然药物紫铆因是否能够抑制 膀胱癌细胞的增殖，及其抑瘤机制尚不清楚。 1 材料与方法 1.1 材料

BLS膀胱移行细胞癌细胞系来自西安交通大学 医学院第一附属医院医学分子中心^[1]。实验动物： 6周龄BALB/c-nude裸鼠12只，雌性，平均体质量 17~20 g，购自中国科学院上海实验动物中心。 紫铆因购自美国Aldrich-Sigma公司，兔抗人组蛋 白H3、NF-κB p65、COX2及鼠抗人CyclinD1、β-actin、Tubulin购自美国Santa Cruz公司。兔抗 人p44/42 MAPK（ERK1/2）及Phospho-p44/42 MAPK(p-ERK1/2)购自美国Cell signaling公司。 1.2 紫铆因工作液的准备

紫铆因相对分子质量272.12，将5 mg紫铆因溶 于230 µl DMSO中，配制成(8×10⁴) µM的母液，置 于-20℃冰箱保存。临用时，以RPMI 1640培养液 稀释紫铆因到所需浓度，保证DMSO的浓度小于 1‰，排除DMSO的细胞毒性作用，工作液的最大 浓度是80 µM，即稀释1 000倍。 1.3 细胞生长抑制实验（MTT法

将细胞按5 000个/孔接种于96孔板，分别加入 终浓度为0、2.5、5、10、20、40、80 µM的紫铆 因培养液。每浓度组均设 5个平行孔。培养48 h； 弃上清液，每孔加入200 μl无血清培养液及20 μl MTT溶液继续培养4 h。弃上清液，加入DMSO， 振荡10 min，于自动酶标仪上进行比色，在波长 490 nm处测各孔光密度值，该实验重复3次，取平 均值。 1.4 平板克隆形成试验

取对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，以 200个/孔的浓度接种到6孔板，分别加入10、20、 40 µM的紫铆因，每组设置5个平行孔，静止培养 2周，弃培养液，固定，染色，计数，按下式计算 克隆形成率：克隆形成率(%)＝克隆数/接种细胞数×100%。 1.5 流式细胞仪检测细胞周期

将细胞培养至对数生长期，无血清RPMI 1640 培养液过夜培养，血清饥饿使细胞同步化在G0 期。弃掉无血清培养液，加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液。经过恢复期后进行相关实验。 加入含20、40、80 µM的紫铆因培养液，继续培养 24 h。消化制备成单细胞悬液，用PBS洗两遍，加 入70%冰乙醇固定，4℃过夜。上机前，1 000转离 心5 min，弃去乙醇，PBS洗三遍，加50 µl PI，避 光30 min，上机检测细胞周期。重复试验3次。 1.6 蛋白印迹法

提取总蛋白，测定蛋白浓度；进行SDS-PAGE 电泳，蛋白电泳转移仪将分离后的蛋白条带转至 硝酸纤维素膜上，一抗4℃冰箱孵育过夜；二抗室 温孵育1.5 h，暗室中ECL曝光显影。发光成像仪取 像并测定条带A值，以待检基因条带与内参条带的 比值作为目的蛋白的相对量。重复实验3次。 1. 7 膀胱癌裸鼠移植瘤体内研究

取对数生长期细胞，用PBS调整浓度到4×10⁷/ml。将裸鼠常规消毒后，在裸鼠左后肢皮下接 种细胞，每只8×10⁶/0.2 ml。接种肿瘤细胞后，在 西安交通大学医学院动物中心无菌空气层流室内 饲养，全部实验饲养过程达到SPF(special pathogen free)条件，定期观察小鼠的精神、饮食及排便等 情况，称量小鼠体质量。接种1周左右，可见接 种部位皮下长出米粒大小的硬结，待瘤体达到 （100~200）mm³时开始治疗。治疗前随机分组， 每组6只，各组裸鼠治疗前体质量经统计学分析无 显著性差异(P>0.05)，表明各组裸鼠体质量在治疗 前具有均衡性。治疗前对照组和紫铆因治疗组间 肿瘤体积经统计学分析无显著性差异(P>0.05)。对 照组：腹腔注射PBS，二天注射一次。药物组：腹 腔注射PBS稀释的紫铆因，每只每次40 μm，二天 给药一次，连续治疗4周。皮下移植瘤疗效观察： 皮下接种成瘤后，每三天用游标卡尺测量肿瘤瘤 体的长径(a)、短径(b)，按公式求出肿瘤近似体积 (V)，V=1/2ab²。治疗后每日观察裸鼠进食、精神 状况及活动情况。实验结束时处死小鼠，称取瘤 体质量。 1.8 统计学方法

使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，结 果以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单 因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学 意义。 2 结果 2.1 紫铆因对细胞增殖的抑制作用

不同浓度的紫铆因（2.5、5、10、20、40、80 µM）作用48 h，MTT法检测结果表明细胞的存活 率分别为（98.4±3.5）%、（96.7±5.2）%、（94.7 ±7.6）%、（91.4±9.24）%、（65.8±10.3）%、 （20±6.8）%，紫铆因抑制BLS细胞的增殖呈浓度 依赖性方式。当紫铆因40 µM及80 µM时对细胞增 殖的抑制与对照组（紫铆因 0 µM）相比差异有统 计学意义（P=0.00），见图 1。

*: P=0.00,Butein 40 um and Butein 80 um vs. control group 图1 紫铆因对膀胱移行细胞癌细胞增殖的影响 Figure 1 Effects of Butein on cell proliferation of bladder transitional cell carcinoma

用不同浓度的紫铆因（0、10、20、40 µM） 处理细胞，培养12天，计算 0、10、20 µM紫铆因 作用下克隆形成率分别为（90.6±3.8）%、（51.6± 3.0）%、（33.6±6.3）%，当紫铆因浓度为40 µM 时无细胞克隆形成。显示紫铆因以浓度依赖性方 式抑制细胞克隆形成能力，差异有统计学意义 （P=0.00）。 2.3 紫铆因对细胞周期的影响

用20、40、80 µM的紫铆因处理细胞24 h，流 式细胞仪观察细胞周期改变。随剂量的进一步增 加，G₂/M期的细胞比例明显增加，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 FCM检测膀胱移行细胞癌细胞生长周期 Table 1 Cell cycles of bladder transitional cell carcinoma detected by flow cytometry Notes:*: P=0.00,compared with Butein 0 µM

表 1 FCM检测膀胱移行细胞癌细胞生长周期 Table 1 Cell cycles of bladder transitional cell carcinoma detected by flow cytometry

20 µM的紫铆因处理后，蛋白印迹检测细胞 核蛋白及胞质蛋白中NF-κB p65的表达，以间接 了解NF-κB信号的激活状态，结果显示处理8 h 后紫铆因即显著抑制了NF- κB p65的胞核表达 （P=0.00），对照组与紫铆因组NF-κB p65蛋白 胞核内相对表达量分别为（1.03±0.12）及（0.16± 0.02），而紫铆因对胞质内NF-κB p65的表达无显 著性影响，见图 2。

图2蛋白印迹检测紫铆因对膀胱移行细胞癌中NF-κB p65表达的作用 Figure 2 Effects of Butein on NF-κB p65 expression in bladder transitional cell carcinoma detected by Western blot

20µM的紫铆因分别处理BLS细胞0、4、8、 24h，Western bolt检测ERK1/2，磷酸化ERK1/2和 内参β-actin的表达。发现紫铆因对ERK1/2的表达 没有显著影响，而抑制了磷酸化ERK1/2的表达水 平，呈时间依赖性方式，其中作用24 h后磷酸化 ERK1/2的表达水平与对照组（紫铆因0 h）相比差 异有统计学意义(P=0.00)，见图 3。

*: P=0.00, compared with Butein 0 h 图3 蛋白印迹检测紫铆因对膀胱移行细胞癌中ERK1/2信号的作用 Figure 3 Effects of Butein on ERK1/2 and p-ERK1/2 of bladder transitional cell carcinoma detected by Western blot

20 µM紫铆因处理24 h后，紫铆因处理组和未 处理组细胞中Cyclin D1蛋白相对表达量为（0.98 ±0.16）和（0.23±0.04）。COX2蛋白相对表达量 为（0.87±0.11）和（0.29±0.06），提示紫铆因 显著抑制了Cyclin D1（P=0.02）及COX2的表达 （P=0.01），见图 4。

图4 蛋白印迹检测膀胱移行细胞癌中CyclinD1及COX2的表达 Figure 4 Effects of Butein on CyclinD1 and COX2 expression in bladder transitional cell carcinoma detected by Western blot

每只裸鼠皮下注射 8×10⁶癌细胞后，各组裸鼠 未出现消瘦、行动迟缓等症状。接种7天后可观察 到皮下小结节，成瘤率100%，治疗后每日观察两 组裸鼠进食、精神状况及活动情况无明显变化。 治疗后，各组裸鼠肿瘤体积均逐渐增大，瘤体起 初为椭圆形，以后生长渐不规则，凸凹不平。对照组肿瘤生长较快，紫铆因组治疗2周后肿瘤生 长停止并呈缩小趋势，统计学分析显示治疗结束 后，治疗组肿瘤体积均小于对照组(P=0.00)，比较 切除肿瘤标本的重量，显示紫铆因治疗组的移植 瘤重量明显小于对照组(P=0.00)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 紫铆因对膀胱癌裸鼠移植瘤生长的作用 Table 2 Effects of Butein on transplanted tumor growth of bladder carcinoma in nude mice Notes:**: P=0.00 ,compared with control group

表 2 紫铆因对膀胱癌裸鼠移植瘤生长的作用 Table 2 Effects of Butein on transplanted tumor growth of bladder carcinoma in nude mice

在目前的肿瘤治疗中，存在着作用小、费用 高、不良反应大的缺点，寻找高效、价廉、不良 反应相对小的天然药物有着非常重要的意义。紫 铆因是一种植物多酚，是漆树科植物漆树（rhus verniciflua stokes）皮的主要活性成分。在亚洲 是一种中药，在韩国也被用于食品添加剂。许多 体外研究发现紫铆因除了具有抗炎及抗纤维化作 用，可以抑制包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌等许 多种人类肿瘤细胞的增殖^[2,3,4]，本研究结果显示， 膀胱癌细胞的存活率及克隆形成率随着紫铆因处 理浓度的增加逐渐下降，显示出明显的剂量依赖 关系；体内实验证实紫铆因对膀胱移行细胞癌皮 下移植瘤有明显的抑制作用，这些结果表明紫铆 因显著地抑制了膀胱癌细胞的增殖能力。细胞经 药物作用后，发生DNA损伤，细胞会启动细胞周 期检查点，产生细胞周期阻滞，从而抑制了细胞 的增殖。本实验采用流式细胞术测定紫铆因不同 处理浓度下细胞处于细胞周期各时相的百分比。 结果表明：紫铆因处理细胞后G₂/M期细胞明显增 多，提示紫铆因可能通过阻滞细胞在G₂/M期发挥 生长抑制作用。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶K(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族的主要成员，是调节细 胞周期及促进细胞增殖分化的重要因子^[5]。紫铆因 是特异性的酪氨酸激酶抑制剂。它抑制了表皮生 长因子（EGF）受体的磷酸化激活^[6]。Yang等^[7]研 究发现紫铆因通过调控MAPK通路抑制了乳腺癌细 胞的增殖，本研究证实紫铆因显著抑制了ERK1/2 的磷酸化。ERK1/2作为传递细胞增殖信号的重要 因子，也在NF-κB的激活中发挥重要作用^[8]。NF-κB是重要的核转录因子，最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体，与其抑制蛋白IκBs形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中，受到各种 活化因素的作用后，NF-κB被激活进入到核内， 调控多种涉及细胞增殖、存活、肿瘤侵袭和转移 及肿瘤血管形成等基因的表达。由于基因突变、 慢性炎性反应等因素所致的NF-κB异常活化可促进 细胞增殖、加速肿瘤细胞转移、提高肿瘤细胞对 放、化疗的抗性，最终促进肿瘤的发生与发展， 因此，NF-κB活性抑制剂将有助于肿瘤的防治^[9]。 研究表明紫铆因通过直接抑制IKKβ的磷酸化抑制 了NF-κB的活性以及NF-κB调控基因的表达^[10]。 NF-κB在膀胱癌中常表现为组成性激活，我们的数 据进一步证实紫铆因抑制了膀胱癌细胞中NF-κB活 性。这些结果暗示紫铆因发挥抗癌作用可能涉及 ERK1/2和NF-κB两条信号通路。

Cyclin D1基因中有NF-κB连接位点，NF-κB通 过调控Cyclin D1参与细胞周期的调控，促进细胞 增殖^[11]。COX2也是NF-κB的重要下游靶点，COX2 在正常组织中基本不表达，而在炎性反应和多数 肿瘤组织中高表达，通过启动炎性反应，促进肿瘤 细胞增殖及肿瘤微血管形成影响肿瘤发生发展^[12]。 那么紫铆因是否抑制这些蛋白的表达，我们通过 蛋白印迹检测了紫铆因处理组和未处理组细胞中 Cyclin D1及COX2参与肿瘤增殖的蛋白表达，发现 紫铆因处理后Cyclin D1及COX2显著下调。

综上所述，本研究发现紫铆因在膀胱癌细胞 中通过阻断ERK1/2和NF-κB信号通路，继而下调 Cyclin D1及COX2细胞增殖相关基因而发挥了明显 的抗膀胱癌增殖作用。因此，紫铆因作为一种天 然化合物有望成为膀胱癌治疗中的辅助用药。