人表皮生长因子受体-2(HER2)基因，编码 P185，是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、酪氨酸激酶受体家族的一 员，与EGFR家族其他成员形成异二聚体，产生强 烈的致瘤作用。临床研究表明，非小细胞肺癌患者 存在HER2基因的过表达^{[ 1 ]}，与其化疗耐药有关^{[ 2 ]}。 本研究通过构建能够稳定表达HER2短发卡RNA （short hairpin RNA，shRNA）的质粒载体，转染 小鼠肺腺癌Lewis细胞株，探讨HER2 shRNA表达 载体抑制HER2表达能否增强癌细胞对卡铂化疗的 敏感度。 1 材料与方法 1.1 材料

小鼠肺腺癌Lewis细胞株（由泸州医学院免 疫学实验室提供）。高糖DMEM培养液（美国 Invitrogen公司）、胎牛血清（Hyclon公司）。 pGPU6/RFP/Neo-erbB-2、pGPU6/RFP/NeoshNC (上海吉玛公司构建)，Lipofectamine 2000 Reagent、 Trizol（美国Invitrogen公司）。焦炭酸 二乙酯（DEPC）（美国Sigma公司）、RT-PCR 试剂盒（日本Toyobo公司）。HER2鼠单克隆抗体 （Abcam公司）、羊抗鼠二抗（碧云天）。卡铂 （齐鲁制药有限公司），Annexin Ⅴ-FITC Kit凋亡 试剂盒（凯基公司）。 1.2 小鼠肺腺癌Lewis细胞株的培养

Lewis细胞株常规培养于含10%胎牛血清和 青、链霉素的高糖DMEM培养液中，于37℃、5% CO²培养传代。 1.3 转染

将对数生长期Lewis细胞株以2×10⁵个/孔接种 于六孔板，细胞长满70%时进行转染。实验分组： pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组、pGPU6/RFP/Neo-shNC 组、未转染对照组。以Lipofectamine 2000为转染 试剂，按照说明书进行转染。 1.4 RT-PCR检测HER2 mRNA的水平

转染48 h后，用Trizol试剂抽提每组细胞的总 RNA，反转录，按照试剂盒说明以GAPDH为内参 PCR扩增HER2。HER2上游引物：5’-GCCATCACC AGTGACAATAT-3’，下游引物：5’-TGATCTCCTC CAGGGTTTC-3’，产物长157 bp；GAPDH上游引 物：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’，下游 引物：5’-CTCGCTCCTGGAGAGTGGTG-3’，产物 长233 bp。反应条件：94℃，2 min；(94℃30 s； 55℃30 s；72℃1 min)，32个循环；72℃5 min。 1.5 Western blot检测HER2蛋白的表达

转染72 h后，用PBS洗细胞三次，用细胞裂解 液裂解细胞提取总蛋白，上样进行SDS-PAGE电 泳，转膜，封闭，依次加入HER2单抗、羊抗鼠二 抗，显色，拍照。 1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

实验分组：未转染组、pGPU6/RFP/Neo-shNC 组、pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组、卡铂（60 μg/ml） 组、pGPU6/RFP/Neo-shNC+卡铂组、pGPU6/RFP/ Neo-erbB-2+卡铂组。消化细胞，制成单细胞悬 液，洗涤两次。加入binding buffer每管500 μl，重 悬细胞。加入Annexin Ⅴ-FITC每管5 μl混匀后，加 入PI每管5 μl，混匀，室温、避光，反应5 min，上 流式细胞仪检测细胞凋亡。 1.7 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件分析，计量资料以x±s 表示，多样本均数两两比较采用q检验，P<0.05为 差异有统计学意义。 2 结果 2.1 RT-PCR检测HER2 mRNA的水平

pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组的HER2 mRNA水平 显著低于pGPU6/RFP/Neo-shNC组和未转染组，见 图1。

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; M:marker; 1:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 group;2:pGPU6/RFP/Neo-shNC group; 3:non- transfected group 图1 RT-PCR检测HER2 mRNA水平 Figure 1 HER2 mRNA level tested by RT-PCR

pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组的HER2 蛋白表达显著 低于pGPU6/RFP/Neo-shNC组和未转染组，见图2。

1:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 group;2:pGPU6/RFP/Neo-shNC group; 3:non-transfected group 图2 Western blot检测HER2蛋白表达 Figure 2 HER2 protein level tested by Western blot

pGPU6/RFP/Neo-erbB-2+卡铂组的凋亡 率高于未转染组、pGPU6/RFP/Neo-shNC组、 pGPU6/RFP/Neo-erbB-2组、卡铂组、pGPU6/RFP/ Neo-shNC+卡铂组，差异有统计学意义（P均 ＜0.01），见图3、表1。

A:non-transfected group; B:pGPU6/RFP/Neo-shNC group; C:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 group; D:carboplatin group; E:pGPU6/RFP/Neo-shNC plus carboplatin group; F:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 plus carboplatin group 图3 流式细胞术检测Lewis细胞的凋亡率 Figure 3 Apoptotic rates of Lewis cells tested by FCM

表1(Table 1)

表1 Lewis细胞的凋亡率 Table 1 Apoptotic rates of Lewis cells Notes:*:P＜0.05,**:P＜0.01, compared with non-transfected group; ☆:P＜0.01, compared with pGPU6/RFP/Neo-erbB-2 plus carboplatin group; ▲:P＜0.05, ▲▲:P＜0.01, compared with carboplatin group

表1 Lewis细胞的凋亡率 Table 1 Apoptotic rates of Lewis cells

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺 癌约占所有肺癌病例的84% ^{[ 1 ]}。以铂类药物为主的 化疗在肺癌的治疗中一直具有重要的意义，但容易 形成耐药性。非小细胞肺癌患者存在HER2蛋白过 度表达，且腺癌的阳性率最高^{[ 2 ]}。过表达HER2蛋 白的非小细胞肺癌患者及人的非小细胞肺癌株对 长春瑞滨、顺铂、阿霉素等化疗药物存在耐药性 ^{[ 3, 4 ]}。HER2基因位于人染色体17q21，编码P185， 是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体。HER2 通过以下信号转导途径来调节细胞生存和增殖： ras/raf/线粒体活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶向基因 （mammalian target of rapamycin,mTOR）途径^{[ 5 ]}。 HER2过表达或结构的异常变化常可导致细胞生长 异常及癌肿的形成。

RNA干扰是应用特异的siRNA有效抑制内源性 基因的表达。由于RNA干扰具有高效、特异、快 速、不良反应小等优点，且能在转录后显著抑制 基因的表达，是研究基因功能的重要工具，并逐 步成为对肿瘤、病毒性疾病等进行基因治疗研究 的一种手段^{[ 6, 7 ]}。有研究^{[ 8, 9 ]}显示，HER2 siRNA能 增强人肺腺癌细胞株对铂类化疗药物的敏感度。 本实验中，pGPU6/RFP/Neo-erbB-2表达载体能抑 制小鼠肺腺癌Lewis细胞株HER2基因的表达，并 且能增强该细胞对卡铂的敏感度，为后期构建低 表达HER2基因的小鼠肺腺癌模型并进行小鼠模型 化疗增敏方面的实验奠定了基础。