原发性肝细胞肝癌（以下简称肝癌）是世界 范围内常见的恶性肿瘤之一，每年全世界新增约 63万例肝癌患者，死亡人数约60万人，确诊的患 者大多在一年内死亡^[1，2]。如何安全有效地治疗肝 癌，成为该研究领域关注的热点。随着人们对肝 癌发病机制的深入认识和基因治疗技术的逐步成 熟，肝癌的基因治疗有望成为新的治疗方法^[3]。 目前，人们已经从分子生物学水平对其进行了大 量研究，如相关癌基因的激活、抑癌基因的失活 等。Foxp1（forkhead box p1）基因是新近发现的 一种转录因子，属于FOX家族的P亚族，该家族是 一个庞大的转录因子家族，功能广泛，涉及胚胎 的正常发育、细胞凋亡和细胞周期、糖类和脂类 代谢、生物老化、免疫调节等多种生物学过程^[4]， 并且在多种肿瘤中均有表达^[5]，其蛋白产物在不同 的肿瘤中具有不同的生物学作用^{[6，7，8，9]}。

RNAi现象是生物体内双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）在Dicer酶的作用下特异性 地被裂解为21~23 nt的dsRNA，即干扰性小RNA （small interfering RNA或short interfering RNAs, siRNA），进而形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）诱导同源靶基因mRNA 发生特异性降解，从而导致基因沉默^[10]。但是 siRNA引起的基因沉默必须在靶细胞内实现，哺乳 动物细胞不接受裸露的、没有细胞穿透能力（不 管是否经过化学修饰）的siRNA序列。所以如何将 siRNA序列转入细胞内引起特异序列的基因沉默是 细胞执行siRNA的关键。由反转录病毒构建的慢 病毒载体为不含致病基因、无复制能力，但能感 染几乎所有体细胞^[11，12]，所以本文拟通过构建具有 三质粒分装系统的慢病毒载体将体外合成的干扰 Foxp1功能的核酸片段（siRNA Foxp1）感染高表 达Foxp1的肝癌细胞，通过检测细胞内Foxp1表达 水平来评估慢病毒载体的功能，并探讨Foxp1对癌 细胞增殖、凋亡和迁移的影响。

1 材料和方法 1.1 细胞株和试剂

四株肝癌细胞株（7721、7402、97H、 HepG2）、感受态大肠杆菌（TOP10）、人肾胚细 胞（293T）、慢病毒三质粒（pLL3.7、pMD2.G、 psPAX2）均购于百奥迈科生物技术有限公司。 DMEM培养液、胎牛血清、脂质体Lipofectamine 2000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司。 PVDF膜购自美国Pharrnacai公司。人抗鼠Foxp1抗 体、β-actin 抗体和HRP偶联的二抗均购于美国 Santa Cruz公司。

1.2 方法 1.2.1 筛选高表达Foxp1 mRNA的肿瘤细胞

将四株肝癌细胞分别置于含10%胎牛血清 的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内 培养。分别采用TRIzol试剂盒提取四种细胞的总 RNA，反转录成cDNA，其步骤如下：RNA 4 μl、 oligo dT 1 μl、dNTP 1.5 μl，70℃5 min，立即 置冰上5 min；5×M-MLV反转录酶Buffer 9 μl、 M-MLV反转录酶0.3 μl、Rnase InHibiter 1 μl、 DEPC H2O 9.5 μl，42℃60 min，95℃30 s。实时 荧光定量PCR（real time Q-PCR，RT- QPCR）检 测四种细胞中Foxp1 mRNA表达水平，反应体系 为：cDNA 1 μl、2×QPCR master mix 12.5 μl、引 物F 0.5 μl、H2O 9.5 μl 。Foxp1引物（序列为F： 5’ -TCAGAGATTACGAAGATGAATTCAAGAGAT TCATCTTCGTAATCTCTGTTTTTTC-3’，55 bp； R：5’-TCGAGGAAAAAACAGAGATTACG AA GATGAATCTCTTGAATTCATCTTCGTAATCTCT GA-3’，60 bp），GAPDH为内参（序列为F：5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，19 bp；R：5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，20 bp）均由百 奥迈科生物技术有限公司合成。反应条件：95℃ 预变性3 min后，95℃变性45 s，60℃退火45 s， 72℃延伸30 s，共35个循环，72℃再延伸7 min。 收集RT- QPCR反应荧光信号，进一步做产物熔解 曲线分析，检测qPCR产物的特异性。qPCR数据用 2 ^-ΔΔCt法进行分析^[13]，用7721细胞做均一化，得到 目的基因Foxp1在不同细胞中的相对表达量。筛选 高表达Foxp1 mRNA的癌细胞用于后续实验研究。

1.2.2 靶向Foxp1 mRNA的siRNA序列筛选

设计分别靶向Foxp1基因823、1 015和2 516碱 基位的三对siRNA序列，见表 1。进行序列比对 （BLAST），确定与人类其他基因组没有同源 性，并注意了G/C的百分比为50%以上，避免选取 高G含量或连续G区段。三条siRNA序列均由百奥 迈科生物技术有限公司协助合成。将高表达Foxp1 的癌细胞接种于24孔培养板中进行培养，当细胞 生长融合达到80%时参照Lipofectamine 2000转染 试剂操作说明将上述三对siRNA靶序列分别转染培 养细胞。转染后48 h提取总RNA，RT-QPCR检测 Foxp1 mRNA表达水平，GAPDH （Glycoraldelyde-3-phosphate dehydrogenase）为内参。反应条件同 上。筛选较高抑制能力的siRNA序列用于构建靶向 Foxp1的siRNA慢病毒载体。

表 1(Table 1)

表 1 靶向Foxp1基因823、1 105和2 516碱基位的siRNA序列 Table 1 siRNA sequences of targeted Foxp1-823, 1 015 and 2 516

表 1 靶向Foxp1基因823、1 105和2 516碱基位的siRNA序列 Table 1 siRNA sequences of targeted Foxp1-823, 1 015 and 2 516

1.2.3 构建靶向Foxp1的siRNA慢病毒载体

将带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）有利于细胞转染后跟踪观察的质粒 pLL3.7由内切酶Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ进行双酶切后，用 DNA连接酶将体外合成的具有较高特异性siRNA Foxp1序列插入到慢病毒的转移质粒中连接成环 状，构建pLL3.7- siRNA Foxp1重组质粒，见表 2。 转化感受态大肠杆菌TOP10，在LB琼脂平板上培 养后，挑取白色单菌落，用特异引物进行PCR扩 增，反应条件同上。以重组成功的pLL3.7质粒作 为对照标准样品。电泳检测扩增产物送上海美吉 生物医药科技有限公司测序，验证其准确性。

表 2(Table 2)

表 2 构建慢病毒载体的核酸序列 Table 2 Nucleotide sequence of the recombinant lentiviral vector

表 2 构建慢病毒载体的核酸序列 Table 2 Nucleotide sequence of the recombinant lentiviral vector

病毒颗粒的复制由三质粒系统转染人胚肾293T 细胞产生。将新制备的含有Foxp1-siRNA序列pLL3.7 重组质粒和另外两个质粒pMD2.G、psPAX2，按 如 下比例：20 μg pLL3.7-Foxp1，12 μg psPAX2和5 μg pMD2.G溶于转染试剂（Gibco-BRL,Gaithersburg, MD）室温静置30 min组成慢病毒三质粒系统，待 293T细胞生长融合达到50%时轻轻加入慢病毒三 质粒系统。4~6 h后换新鲜培养液，72 h后收集， 低速离心（800 r/min，5 min）去杂质，1 ml磷酸 盐缓冲液重悬沉淀物，储存于-80℃。用RNA抽 提试剂盒提取培养液样品中病毒内的RNA，再反 转录成cDNA与供参照的标准样品（重组成功的 pLL3.7质粒）同时进行RT-QPCR检测，反应体系 和反应条件同上，构建靶向Foxp1的siRNA慢病 毒载体（lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA）（MOI值为 20）。同时构建不含有Foxp1-siRNA序列的直接三 质粒系统包装的空病毒载体作为对照组，步骤同 前。

1.2.4 检测lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA感染细胞后Foxp1的表达

将高表达Foxp1的癌细胞以2×10⁵/孔接种于6孔 培养板，培养24 h后加入lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA 继续培养，分别在24、48、72 h，荧光显微镜下 观察细胞中siRNA Foxq1序列的荧光信号。并在培 养72 h后，分别进行RT-QPCR检测Foxp1 mRNA表 达水平（反应条件同上）和Western blot检测细胞 中Foxp1蛋白的表达。Western blot采用常规方法操 作：细胞经lenti-pLL3.7-siRNA Foxp1处理48 h后提 取各组细胞蛋白，用胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤 一次，每孔细胞以15 μl PBS悬浮。改良Lowry法测 定蛋白浓度，调整平衡蛋白量。样品与2×SDS上 样缓冲液[0.1 mol/L Tris-HCl（pH6.8），4%SDS， 20%甘油，0.1%溴酚蓝，5%β-巯基乙醇]等体积 混合，95℃水浴5 min变性，每孔上样量为15 μg蛋 白，等量上样于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE电泳）。电泳结束后，采用半干转印仪 （BIO-RAD公司）以15V恒压转印1 h，将凝胶中 蛋白质转移到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶封闭 后，加TBST稀释的鼠抗人Foxp1抗体（1400） 中，4℃孵育过夜；加经辣根过氧化物酶（HRP） 标记的羊抗鼠IgG抗体（11 000）室温反应2 h， 于暗室中显影，显色采用ECL化学发光剂（super signal west pieo chemiluminescent substrate,Cat NO34077,PIERCE）Kadak曝光显影。以β-actin作 为内参。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖活力

将高表达Foxp1的癌细胞以5×10³/孔接种于96孔 培养板，用含10%胎牛血清的DMEM基础培养液 孵育24 h后加入lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA，分别再 培养24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl， 继续孵育1.5 h，选择450 nm波长，在酶标仪上测 定各孔吸光度值（OD值），记录结果，绘制细胞 生长曲线。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

在培养的高表达Foxp1的癌细胞中加入lentipLL3.7-Foxp1-siRNA后继续培养48 h，收集细胞， 0.01M PBS洗涤2次，加入500 μl结合缓冲液制成 细胞悬液，与5 μl Annexin V、5 μl PI（propidium iodide）共同孵育15 min，上机检测，CellQuest软 件进行分析。

1.2.7 检测细胞迁移能力

（1）检测细胞二维空间迁移的划痕愈合实 验：将高表达Foxp1的癌细胞以2×10⁴/孔接种于 24孔培养板，培养24 h后加入lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA，继续培养48 h。待细胞融合后，用10 μl移 液器垂直培养板底部呈“一”字形划痕，镜下记录 划痕区相对距离，DMEM培养液洗涤后，用100 μl无抗DMEM FCS培养液继续培养。划痕后24、 48 h，倒置显微镜下观察细胞从划线处向外爬出 的数量与距离，随机选取5个视野（×40），用软 件（Image-ProPlus,version 4.5.1,美国）测量，计 算均值。（2）检测细胞三维空间迁移的细胞侵 袭小室实验：将高表达Foxp1的癌细胞以2×10⁴/孔 接种于24孔培养板，培养24 h后加入lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA，继续培养72 h。2.5%胰酶消化后 重悬于不含血清的DMEM培养液中，细胞浓度为 1×10⁶。将200 μl细胞悬液加于上室，下室为600 μl DMEM培养液（含10%胎牛血清），在37℃、 5%CO2条件下培养24 h。擦去膜上层细胞，取膜经 甲基紫染色后，镜下可见穿膜细胞呈紫色。每孔 随机计数5个视野，取其均值。

1.3 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件包，数据表示用均数± 标准差（±s），计数资料比较采用方差分析和t检 验。率的比较用卡方检验。P<0.05为差异有统计 学意义。

2 结果 2.1 选择高表达Foxp1 mRNA的肝癌细胞

RT-QPCR检测四种不同的肝癌细胞中Foxp1 mRNA的结果显示：7721细胞中Foxp1 mRNA的表 达分别明显高于其他三株细胞7402、97H和HepG2 细胞的9倍、2.01倍和5.1倍，差异均有统计学意义 （P<0.05），见图 1。因此选用7721细胞作为高表 达Foxp1的细胞用于后续研究。

图 1

Fig. 1

图 1 四种肝癌细胞中Foxp1 mRNA的表达（RT-QPCR）Figure 1 Expression of Foxp1 mRNA in the four different hepatoma carcinoma cells （RT-QPCR）*:compared with expression of Foxp1 mRNA in 7721 cells,which taken as 100%,P<0.05

2.2 选择有效的针对Foxp1的siRNA靶序列

设计针对Foxp1的三对siRNA靶序列被分别转 染入7721细胞，RT-QPCR检测细胞中Foxp1 mRNA 表达，与单纯转染脂质体组比较，Foxp1 mRNA 的沉默效率分别为Foxp1-823-siRNA:78.23%、 Foxp1-1015-siRNA: 55.7%和Foxp1-2516-siRNA: 54.29%，Foxp1-823-siRNA较其他两对siRNA具 有更高的抑制效率（P<0.05），而Foxp1-1015-siRNA和Foxp1-2516-siRNA的抑制效率差异无统计 学意义（P>0.05），见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 Foxp1 siRNA靶序列筛选结果（RT-QPCR）Figure 2 Screening of siRNA Foxp1 target sequences （RTQPCR）A:Foxp1-2516-siRNA; B: Foxp1-823-siRNA; C:Foxp1-1015-siRNA; D:lipo; *: Foxp1-823-siRNA compared with Foxp1-1015-siRNA and Foxp1-2516-siRNA respectively,P<0.05

2.3 Lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA的测序结果

测序结果证实插入序列完全正确，lentipLL3.7-Foxp1-siRNA构建成功。分别在lentipLL3.7-Foxp1-siRNA感染后24、48、72 h，荧光显 微镜下均可见绿色荧光信号，且信号强度随时间推 移逐渐增强，见图 3，表明细胞中持续表达siRNA。

图 3

Fig. 3

图 3 Lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA感染7721细胞后荧光显微镜下检测结果Figure 3 The result of infecting 7721 cells with lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA observed by fluorescence microcopyA:24 h;B:48 h;C:72 h

2.4 Lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA下调7721细胞中Foxp1的表达

RT-QPCR和Western blot检测结果均显示7721 细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后，与空病毒 载体对照组比较，Foxp1 mRNA和蛋白表达均显著 减少（P<0.05），见图 4。

图 4

Fig. 4

图 4 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后Foxp1的 表达Figure 4 Expression of Foxp1 in 7721 cells infected with lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNAA: Foxp1 mRNA level(RT-QPCR); B: Foxp1 protein level(Western blot); 1:Lenti-PLL3.7-Foxp1-siRNA;2: control: the empty viral vector; *:comparaed with the control of the empty viral vector,P<0.05

2.5 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后增殖受抑

CCK-8法检测细胞增殖活力的生长曲线显示： 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后48 h和 72 h，细胞增殖明显低于空病毒载体对照组，尤以 72 h明显（P<0.05），见图 5。

图 5

Fig. 5

图 5 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后的生长曲线Figure 5 Growth curve of 7721 cells infected with lentipLL3.7-Foxp1-siRNA for 24,48 and 72h

2.6 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后凋亡增加

流式细胞仪检测结果显示7721细胞感染lentipLL3.7-Foxp1-siRNA 48 h后，凋亡细胞的比例明 显增加，与空病毒载体对照组比较差异有统计学 意义（P<0.05），见图 6。

图 6

Fig. 6

图 6 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后48h凋亡增加Figure 6 Increased apoptosis of 7721 cells infected with lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA for 48hA: after been stained by Annexin V-FITC and propidium iodide(PI),the normal live cells were not stained(lower left); the apoptosis cells at early stage were only stained by Annexin V-FITC and the PI staining was negative(lower right),such cells in lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA group were significantly more than those in control group; the necrotic cells and apoptotic cells at later staged could be stained both by Annexin V-FITC and PI(upper right). The detection error within tolerance range was showed in upper left; B: the histogram of apoptosis comparing of two groups; *: comparaed with control of the empty viral vector,P<0.05

2.7 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后迁移能力下降

检测划痕愈合实验和细胞侵袭小室实验结果 均显示：细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后细 胞二维空间迁移水平在24和48 h均明显低于空病 毒载体对照组（均P<0.05），见图 7A。感染48 h 后细胞的三维空间迁移能力也受到明显抑制，穿 膜细胞均数（38.49±6.17）较空病毒载体对照组 （124.61±15.22）明显减少（P<0.05），见图 7B。

图 7

Fig. 7

图 7 7721细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后的细胞迁移情况Figure 7 Migration of 7721 cells infected with lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNAA: Wound healing assay; B: Transwell assay; a: penetrating cells observed by microscopy; b: counting statistics of penetrating cells; *: compared with control of the empty viral vector,P<0.05

3 讨论

Foxp1基因位于染色体3p14.1，而3号染色体短 臂（3p）的杂合性缺失是很多恶性肿瘤常见的基 因事件^[14，15]提示Foxp1可能是一个肿瘤抑制基因。 但又有许多肿瘤中Foxp1的过表达造成患者预后不 佳，如不同类型的淋巴瘤等，提示Foxp1可能具有 某种癌基因的作用^[16]。Datta等^[17]研究表明：Foxp1 是microRNA-1（miR-1）基因的作用靶点之一；在 人原发性肝癌中miR-1的表达显著下调，使其靶向 抑制Foxp1的能力下降，导致Foxp1过表达，并与 癌恶性生物学行为有关。当miR-1的表达水平升高 时，通过诱导细胞凋亡和抑制细胞周期进程可以 使肝癌细胞的生长受到明显抑制，而此时Foxp1的 表达是减少的。因此，作者推断Foxp1可能参与了 肝癌的发生。

本研究发现不同的肝癌细胞中均有Foxp1的 表达，但表达水平不一，其机制可能与癌不同的 生物学行为有关（另文研究）。本文选择高表达 Foxp1基因的7721肝癌细胞作为研究Foxp1功能的 细胞，通过下调Foxp1的表达进一步探讨该基因对 肝癌增殖、凋亡和迁移的影响。本文设计了针对 Foxp1的siRNA靶序列，尝试使用慢病毒载体介导 的RNAi技术来下调Foxp1的表达。

siRNA是由短dsRNA作用于同源RNA序列， 在细胞内核酸酶的作用下使得与dsRNA有同源 序列的mRNA降解，从而使目的基因的表达得到 抑制。该方法是抑制基因表达的有效工具，目前 已经成为研究基因功能以及进行基因治疗的新手 段。但实验室常用的方法利用脂质体等转染将 siRNA递达到细胞中发挥作用，但在体内研究表 明脂质体等载体对细胞存在较大毒性、转染效 率低、瞬时转染不能长期沉默基因等缺点，限制 了siRNA技术在体内的研究。基于人免疫缺陷病 毒（HIV-1）的慢病毒家族能够感染分裂及非分 裂细胞、转移基因片段容量大、目的基因表达时 间长、免疫反应小等优点，使慢病毒家族能成为 理想的基因转移载体^[11，12]。正如本文构建不含有 Foxp1-siRNA序列的直接三质粒系统包装的慢病毒 载体对照组感染细胞后，因其为不含致病基因、 在细胞内无复制能力，未产生明显的细胞毒作 用，表明慢病毒载体对细胞是安全的。

本文构建的靶向Foxp1的siRNA慢病毒载体 （lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA）感染7721细胞24、 48、72 h，荧光显微镜下均可见绿色荧光信号， 且信号强度随时间推移逐渐增强，表明细胞中持 续表达siRNA，证明慢病毒载体能有效的将Foxp1-siRNA 递达到细胞中。RT-PCR和western blot检测 结果显示Foxp1 mRNA和蛋白的表达水平显著降 低，说明siRNA在细胞内发挥的降解Foxp1 mRNA 的作用，进而使Foxp1蛋白合成减少。肝癌细胞 感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后能有效抑制其增 殖，促进其凋亡，同时抑制细胞迁移。研究结果 提示Foxp1作为一种多功能转录因子，可能参与肝 癌的演进，发挥癌基因的作用与肝癌细胞恶性生 物学行为有关。进一步研究Foxp1促进肝癌演进的 作用机制有可能为肝癌的发病学增添新的理论依 据，Foxp1基因有可能成为肝癌基因治疗的新靶 点，从而为肝癌的基因治疗提供新的思路。