肿瘤复发或转移是结直肠癌患者死亡的主要 原因。肿瘤转移过程包括一系列步骤：局部浸 润、进入循环系统管腔、转运、外渗、定居、生 长^[1]。因此肿瘤转移的分子机制及预防转移的靶点 成为当前研究热点。

转录调控因子TLE/GRG家族是一类无DNA 结合位点，但能与转录因子结合调控下游基因蛋 白表达的转录调节蛋白^[2]。TLE/GRG家族根据表 达的蛋白分子量大小可分为两类：一类为TLE1-4/ GRG1-4，另 一 类 为AES/GRG5。目前研究发现AES 在眼睛^[3]、骨 骼 ^[4]、腹侧神经管等发育 ^[5]过程中起 重要作用。也有报道结直肠癌原发灶AES表达较 高，而肝脏转移灶中表达缺失，且可能是通过活 化NOTCH通路实现肿瘤转移^[6]。以上研究表明 AES可能参与肿瘤的发生发展，但遗憾的是AES在 肿瘤中的研究甚少。本研究检测了CRC细胞系中 AES表达情况，并将外源性AES质粒转染表达较 低的LoVo细胞系，观察其对CRC细胞系增殖、侵 袭、迁移能力的作用。

1 资料和方法 1.1 材料

人CRC细胞系LoVo、Colo320、sw480、sw620、 s w1116、人胚胎肾HEK293、质粒pEGFP-N1为本实 验室保存。细胞培养液RPMI-1640、小牛血清、 转染试剂Lipofectamine^TM 2000、Opti-MEM购于Invitrogen 公司，兔抗人AES抗体购于Sigma 公 司，鼠抗人 α-tubulin抗体购于博士德公司，CCK-8 试剂盒购于Dojindo公司。

1.2 方法 1.2.1 质粒的构建和细胞转染

通过premier 5.0设计aes(NM_001130)上游引物HindⅢ5’-CC CAAGCTTCCGCGATTGACATGAT-3’、下游 引物KpnⅠ5’-GGGGTACCGTATCCGACTTCT CGCCAT-3’，扩增aes片段，双酶切目的片段 和载体，连到pEGFP-N1，酶切、测序验证。 通过lipofectamine^TM 2000 分别将pEGFP-N1和 pEGFP-aes转入CRC细胞系LoVo，实验分两组： pEGFP-N1组和pEGFP-AES组。

1.2.2 RT-PCR检测aes mRNA的表达

设计aes上 游引物：5’-CACCAGGAGGATGATGGCGAG-3’， 下游引物：5’-GGCGTGGAGGTGTCTGGAACTA-3’，扩增产物为560 bp。内参GADPH上游引物序 列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,下游引 物序列：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。 Trizol试剂提取待测细胞的总RNA，反转录后进行 半定量PCR 扩增：95℃3 min；95℃30 s，57℃ 30 s，72℃30 s，30 个循环，72℃5 min。琼脂糖 凝胶电泳鉴定。

1.2.3 Western blot检测AES的表达

收集对数期待测细胞，RIPA裂解液重悬细胞超声破碎后， 13 400g，4℃，离心15 min。BCA法测定蛋白浓度。 取蛋白样品40 μg，进行12% SDS-PAGE；260 mA横 流，湿转90 min至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h， 一抗4℃过夜，PBS 洗涤3次，二抗避光温育，摇 床2 h，TBST 洗涤2次，以Odyssey红外激发扫描 成像系统扫描成像结果。

1.2.4 细胞增殖能力检测实验

以每孔1×10³细胞 接种于96孔板中，lipofectamine^TM 2000 转染，每天每组3 孔，每孔避光加10 μl CCK-8，37℃培养箱 温育2~4 h，Micro-ELISA仪读取光密度，490 nm波 长，测定各孔吸光值（A），连续5天，记录结果。 实验重复3次。

1.2.5 细胞迁移能力检测实验

以每孔2×10⁵ 细胞接种于6孔板中，lipofectamine^TM 2000转染pEGFP-N1和pEGFP-aes，用移液枪头分别在培 养板底部呈一字形划痕单层培养细胞，每天镜下 记录划痕区的迁移情况，软件分析划痕区的相对 距离，并计算其相对迁移率：（d0记录的相对 距离-d3记录的相对距离）÷d0记录的相对距离× 100%。实验重复3次。（注：划痕单层培养细胞 时间为d0，划痕单层培养细胞后24小时d1，以此 类推。）

1.2.6 细胞侵袭能力检测实验

将BD 悬浮细胞培养小室置入24 孔板中，将BD 基底膜基质胶按1:3 的比例用无血清培养液稀释，取35 μl铺入小室底 层，37℃放置2 h使其凝固；收集转染48 h的细胞， 无血清培养液重悬，将2×10⁵细胞250 μl加入小室， 下层培养板中加入700 μl含20%小牛血清的RIPM 1640培养液。培养48 h后用棉签拭去小室上层细胞， HE染色，显微镜下观察侵袭的细胞数目，计数15个 视野细胞数。实验重复3次。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 18.0统计软件分析，样本 间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异 有统计学意义。

2 结果 2.1 AES在不同结直肠癌细胞系中的表达情况

Western blot表明AES在LoVo、sw620细胞中表 达较低，而在Colo320、sw480、sw116细胞中表达 较高，见图 1。故选择LoVo作为靶细胞进行下一步 相关生物学行为的研究。

Figure 1">图 1

Figure 1">Fig. 1

图 1 CRC 细胞系LoVo、Colo320、sw480、sw620、sw1116中AES表达差异Figure 1 The differential expression levels of AES in CRC cell line LoVo,Colo320,sw480,sw620 and sw1116AES：amino-terminal enhancer of split;CRC：colorectal cancer

2.2 pEGFP-aes重组表达载体的构建、鉴定

从HEK293中提取总RNA，PCR扩增aes目的片 段。构建pEGFP-aes载体，用限制性内切酶Hind Ⅲ 和 KpnⅠ酶切，电泳可见593 bp的aes编码片段， 见图 2。

Figure 2">图 2

Figure 2">Fig. 2

图 2 pEGFP-aes重组质粒酶切鉴定图Figure 2 Restrictive enzyme digestion analysis of constructed vector pEGFP-aes

2.3 外源性pEGFP-AES转染鉴定

RT-PCR、Western blot检测LoVo对照、 pEGFP-N1、pEGFP-AES三组中外源性AES表达 情况。图 3A中可见pEGFR-AES组反转录后可扩增 出AES目的片段。图 3B中显示，三组皆有内源性 AES表达；但与前两组比较，pEGFP-AES组表达 外源性pEGFP-AES融合蛋白。

Figure 3">图 3

Figure 3">Fig. 3

图 3 LoVo中外源性pEGFP-aes在RNA及蛋白水平表达Figure 3 mRNA and protein level of exogenous pEGFP-aes expression in LoVoA:mRNA level；B:protein level

2.4 AES对CRC细胞系LoVo的增殖的影响

将pEGFP-N1、pEGFP-AES分别转染LoVo 后，CCK-8 检测细胞增殖活性，pEGFP-AES与 LoVo 对照组、pEGFP-N1的增殖活性差异并无统 计学意义，见图 4。

Figure 4">图 4

Figure 4">Fig. 4

图 4 AES对CRC细胞LoVo增殖能力的影响Figure 4 The effect of AES on the proliferation of CRC cells LoVo

2.5 AES对CRC细胞系LoVo侵袭能力的影响

与LoVo 对照组、pEGFP-N1组比较，pEGFPAES组中穿过transwell小室基质胶的细胞数目明显 减少（P<0.05），说明转染aes的LoVo细胞穿过基 质胶的能力减弱，可见AES可显著抑制结直肠癌 细胞LoVo的侵袭能力，见图 5。

Figure 5">图 5

Figure 5">Fig. 5

图 5 AES对CRC细胞LoVo的侵袭能力的影响（×200）Figure 5 The effect of AES on the invasion of CRC cells LoVo（×200）

2.6 AES对CRC细胞系LoVo迁移能力的影响

分别以各组第1天的划痕距离为基准， pEGFP-aes组第2天未见明显变化，而LoVo对 照组、pEGFP-N1组第2天的划痕距离明显变窄 （P<0.05），且随着时间延长，该差异愈加明 显。图 6显示，第3天时，pEGFP-AES组划痕距 离是第1天划痕距离的94%~98%（LoVo control组 40%，pEGFP-N1组76%）。可见AES可明显抑制 CRC细胞LoVo的迁移能力。

Figure 6">图 6

Figure 6">Fig. 6

图 6 AES对CRC细胞系LoVo迁移能力的影响（×100）Figure 6 The effect of AES on the migration of CRC cells LoVo（×100）

3 讨论

本研究发现外源性的AES在结直肠癌细胞的 侵袭、迁移过程中发挥抑制作用。众所周知， AES在发育过程中扮演着重要的负性调节作用。 首先，研究发现GRG5活性的缺失能够明显抑制 Runx2+/-GRG5-/-小鼠体内颅缝和囟门的骨化，并 造成严重的长骨生长缺陷^[7]。AES/GRG5还可能 通过Tcf4和Lef1调节出生后的骨生长^[8]。通过GST Pulldown和酵母双杂交实验Zhu等^[9]发现Six3和Six6 需与AES结合从而发挥转录抑制作用；过表达Six3 的鸡胚则影响晶状体的发育。AES也可促进神经细 胞凋亡^[10]，介导神经管内神经细胞形态的退化 ^[5]。

近年来有观点指出AES也是一个肿瘤转移抑 制因子。本实验在体外证明外源性AES表达增高 可抑制肿瘤的侵袭、转移。Jan等^[11]以宫颈癌细胞 系HeLa为研究对象，发现线粒体蛋白Bit1可与AES 结合形成功能性复合物，抑制细胞与胞外基质粘 连，介导细胞凋亡。且来自ONCOMINE数据显 示(http://www.oncomine.org/)众多肿瘤（如前列腺 癌、膀胱癌、乳腺癌等）的转移与AES表达下调 相关。 结直肠癌肝肺转移灶AES较原发灶表达降 低，且AES可抑制鼠的结直肠癌移植瘤肝肺转移 ^[7]。

图 3B中，pEGFP-AES组中出现额外两个条 带，40 kD疑为断裂重组质粒，而118 kD条带究竟 是什么呢？AES可与大分子NF-κB、AR等形成复 合体抑制后者的活性^[12，13]。本实验室研究也发现在 肝癌细胞系中可观察到点状浓积物^[14]。核内化的 AES同NOTCH通路信号分子Rbpj/NICD/Maml1复 合物形成点状浓积物，抑制肠多发息肉鼠肿瘤细胞 侵袭和血管内渗，AES并不能抑制其通路活性^[8]。因 此，AES抑制肿瘤转移的其他机制仍是我们研究努 力方向。实验中我们发现的AES不能影响CRC细胞 系LoVo的增殖与肝癌细胞中的研究结果一致^[14]。 体内实验也证实AES上调或下调的结直肠癌移植瘤 原发灶大小较对照组都无明显差异^[7]，而流式细胞 仪比较实验组与对照组细胞凋亡得出了阴性结果。

综上，本实验研究发现在体外AES可抑制结直 肠癌侵袭迁移。AES该抑制肿瘤转移的作用可为结 直肠癌的转移研究提供一个新的靶点和视角，也是 晚期结直肠癌治疗的和预后预测一个新的导向。