血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮的前体细胞，可增殖、移行、分化为血管内皮细胞。其主要存在于骨髓，处于 不同分化阶段，具有向肿瘤组织募集性和促血管 生成。生理状态外周血EPCs数量很少，病理状态 骨髓EPCs可经动员进入外周循环。某些细胞因 子、趋化因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）^[1]通过作用于 EPCs表面的两种受体即血管内皮生长因子受体1和 2（vascular endothelial growth factor receptor 1 and 2，VEGFR1,2），诱导EPCs的增殖、调节黏附分子的表达而从而促进血管生成。

近年研究表明，蜂毒素（Melittin）对骨肉瘤 细胞、血管内皮细胞、肝癌细胞等均有明显杀伤 及抑制作用^{[2, 3, 4]}。其对血管内皮的前体细胞EPCs 是否也有杀伤及抑制作用，这些国内外还未见报 道。因此，我们在前期基础上，拟采用细胞和分 子生物学等方法，研究蜂毒素阻滞VEGF诱导的 EPCs成血管作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料

SD大鼠，雄性，4~6周龄，体重150 g左右，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物 合格证号：SCHG(沪)2007-0005，在第二军医大 学动物实验中心SPF条件下分笼饲养，自由觅 食、饮水。M199培养液、胎牛血清购自Gibco公 司；0.25%胰蛋白酶购自Hyclone公司；蜂毒素 （批号：127K4872）购自SIGMA公司；兔抗鼠 VEGFR1、VEGFR2单克隆抗体购自Abcam公司(美 国)；兔抗鼠P-AKT、AKT单克隆抗体购自CST(美 国)；兔抗鼠P-ERK1/2、ERK1/2单克隆抗体购自 Promega公司（美国）；VEGF 和bFGF生长因子购 自PROSPEC公司（以色列）；Matrigel胶购自美国 BD公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 EPC培养计数

所有动物实验均获第二军医 大学实验动物伦理委员会监督批准。SD大鼠股骨 和胫骨骨髓被收集，单个核细胞通过密度离心法分 离，收集。经过PBS两次洗涤后，细胞被悬浮于添 加了10% FBS，10 ng/ml VEGF和10 ng/ml bFGF的 M199培养液中，然后被接种于预铺了RFN的培养 皿中。在37℃，5% CO ₂培养箱中孵育培养，4天后 第一次换液，然后每隔3天换一次培养液。 1.2.2 蜂毒素对EPCs增殖能力影响

EPCs被胰 酶消化，吹散，悬浮于含10% FBS的M199培养液 中。细胞计数，按10 000个细胞/孔，每组3个复 孔，铺于96孔板中，增湿培养箱中孵育24 h。24 h 后，将细胞换成含5% FBS的培养液“饥饿”6 h。细 胞分别被加入不同浓度蜂毒素（0、1、2、4、8、 16 μg/ml），37℃，5% CO ₂增湿培养箱中孵育。 48 h后加入10 μl MTT，细胞再被孵育6 h，然后吸 除上液，加入200 μl的DMSO摇床摇晃10 min，490 nm光波下测OD值。计算细胞生长抑制率。实验重 复3次。 1.2.3 蜂毒素对EPCs黏附能力影响

EPCs被消 化、悬浮、计数，按细胞1×10 ⁵/孔，每组3个复孔，接种于预铺RFN的12孔板中。分四组：0 μg/ml（对 照）组，蜂毒素0.5、1、2 μg/ml组，37℃、5% CO ₂增湿培养箱中孵育，各组均用预加血管内皮生长因 子的培养液孵育。2 h后，吸除培养液，PBS清洗2 遍，95%酒精固定30 min，PBS清洗2遍，0.1%结晶 紫200 μl染色15 min，PBS清洗2遍，吹干板底，倒 置光学显微镜（OLYMPUS）观察（×100），随机 视野下拍照，计数贴壁细胞数。实验重复3次。 1.2.4 蜂毒素对EPCs迁移能力影响

通过24孔 Transwell小室评估EPCs的迁移能力。Transwell小 室上室和下室之间有一层含直径8 μm小孔的聚碳 酸脂膜。在聚碳酸脂膜下朝面预铺RFN。下室加 入含2% FBS的M199。分四组：0 μg/ml（对照） 组，蜂毒素0.5、1、2 μg/ml组。上室加入含1×10 ⁵个EPCs的预加血管内皮生长因子的M199培养液 200 μl。37℃、5% CO ₂培养箱中孵育6 h。然后吸 除培养液，棉签拭去聚碳酸脂膜上朝面的细胞，PBS清洗2遍，95%酒精固定30 min，PBS清洗2 遍，0.1%结晶紫染色，PBS清洗2遍，吹干。置于 倒置光学显微镜（OLYMPUS）观察（×100），随 机视野下拍照，计数透过聚碳酸脂膜细胞数。实 验重复3次。 1.2.5 蜂毒素对EPCs小管形成影响

冰上操 作，Matrigel胶120 μl/孔被预铺于48孔板中。每 组3个复孔。分四组：0 μg/ml（对照）组，蜂 毒素0.5、1、2 μg/ml组。预铺Matrigel胶48孔板 被放入37℃培养箱中聚合30 min后，含5×10 ⁴个 EPCs的预加VEGF的M199培养液200 μl被接种于 Matrigel胶上。37℃、5% CO ₂孵育24 h后，Matrigel 胶内出现小管网状结构。置于倒置光学显微镜 （OLYMPUS）观察（×100），随机视野下拍照，Image tool软件计算小管网状结构的管腔面积。实验重复3次。 1.2.6 Western blot法检测蜂毒素对EPCs的VEGFR1、VEGFR2、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2表达的影响

细胞被裂解液裂解，通过BCA分析法测定蛋 白含量。在8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后湿转法转移至聚偏(二)氟乙烯（PVDF）膜 上。PVDF膜室温下被5%牛奶封闭2 h后，TBST液 洗三次，每次10 min。加入相应一抗，4℃孵育过 夜。TBST液洗三次，每次10 min。加入对应的二 抗，室温下孵育1 h TBST液洗三次，每次10 min。 最后含有相应蛋白条带的膜被加入增强化学发光 底物，ECL系统下曝光显影。拍照分析。 1.3 统计学方法

应用SPSS 15.0软件进行统计学分析，数据用 均数±标准差（ x±s）表示,多组间均数比较采用单 因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P﹤0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 蜂毒素对EPCs增殖的影响

不同浓度蜂毒素作用48 h后，提示2 μg/ml以上 浓度能显著抑制EPCs的生长增殖（P﹤0.05），见 图1。由于2 μg/ml以上浓度的蜂毒素有明显的细胞 毒性，以下实验选择不高于2 μg/ml的蜂毒素作用 于EPCs。

图1

Figure 1

图1 MTT法检测蜂毒素对EPCs增殖的影响Figure 1The effects of Melittin on proliferation of EPCs by MTT assayEPCs: endothelial progenitor cells; *: P＜0.05 vs.0 g/ml group

通过计数培养皿底贴壁的细胞数目来确定蜂 毒素对EPCs黏附的影响作用。光学显微镜下观 察结果显示,蜂毒素0、0.5、1和2 μg/ml浓度组 贴壁细胞数目分别为（900.06±59.3）、（820± 70.35）、（532.4±101.95）和(430±70.06)个。1、 2 μg/ml组与0 μg/ml组比较，差异有统计学意义（P ﹤0.05），见图2。

图2

Figure 2

图2不同浓度蜂毒素对EPCs黏附的影响Figure 2The effects of Melittin on adherence of EPCsA: 0 μg/ml group; B: 0.5 μg/ml group; C:1 μg/ml group; D:2 μg/ml group; *: P＜0.05 vs.0 μg/ml group

通过计数聚碳酸脂滤膜底面的细胞数目来确 定蜂毒素对EPCs迁移的作用。实验结果显示，在 蜂毒素0.5~2 μg/ml浓度范围内EPCs迁移数目逐渐 减少。1、2 μg/ml组与0 μg/ml组比较，差异有统计 学意义（P﹤0.05），见图3。

图3

Figure 3

图3不同浓度蜂毒素对EPCs迁移的影响Figure 3The effects of Melittin on migration of EPCsA: 0 μg/ml group; B: 0.5 μg/ml group; C:1 μg/ml group; D:2 μg/ml group; *: P＜0.05 vs.0 μg/ml group

光学显微镜下观察结果显示：蜂毒素0.5、1和 2 μg/ml组形成管状结构的数目减少，且小管间距 离增大，管状结构不完整。经图像分析量化后发 现，蜂毒素1和2 μg/ml组管状结构面积与0 μg/ml组 比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），见图4。

图4

Figure 4

图4不同浓度蜂毒素对EPCs小管形成的影响Figure 4The effects of Melittin on network tube formation of EPCsA: 0 μg/ml group; B: 0.5 μg/ml group; C:1 μg/ml group; D:2 μg/ml group; *:P＜0.05 vs.0 μg/ml group

结果显示：蜂毒素在2 μg/ml浓度下能显著的 抑制EPCs的AKT和ERK1/2的磷酸化。同时，蜂 毒素也能明显的下调血管内皮生长因子受体2的表 达。而这个结果是和磷酸化的AKT和ERK1/2表达 下调相一致的，见图5。

图5

Figure 5

图5蜂毒素对EPCs血管内皮生长因子受体2磷酸化的影响Figure 5The effects of Melittin on VEGFR2 phosphorylation in EPCsVEGF:vascular endothelial growth factor; P-AKT: phosphorylated serine/threonine kinase; P-ERK: phosphorylated extracellular signalregulated kinase; VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor

Asahara等^[5]于1997年首次在成人外周血中发 现EPCs，其后的研究发现骨髓中同样存在EPCs，且外周血的内皮祖细胞可来源于骨髓^[6]。骨髓来源 的EPCs可迁移并结合到活跃的血管再生部位，增 殖、迁移并进一步分化为成熟内皮细胞，参与局 部新生血管的形成。作为具有分化为成熟内皮细 胞潜能的多能干细胞，EPCs具有很强的体外增殖 能力和集落形成能力，并且表现出高度的体外和 体内血管生成能力^[7]。Mukai等^[8]研究发现EPCs体 外培养可以在Matrigel胶的三维模型中形成管状结 构。Tamura等^[9]用正电子发射断层摄影术非侵入 性及时跟踪EPCs在鼠肿瘤模型体内的情况，观察 了EPCs迁移到肿瘤组织参与肿瘤血管发生的具体过程，从影像学角度证实了EPCs参与肿瘤血管发 生。Vajkoczy等^[10]经静脉移植EPCs，检测到这些 EPCs聚集到肿瘤微血管，并穿过内皮到达组织间 隙，形成多细胞群落，分化为成熟内皮细胞参与 血管新生。

血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)家族包含有3种亚 型：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。其中VEGFR1 主要分布在血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞 和单核细胞；VEGFR2主要分布在血管内皮细胞和 淋巴内皮细胞中。VEGFR2是一种Ⅲ型的跨膜蛋白 激酶，在细胞内部时被翻译为约有150 ku且没有明 显糖基化的蛋白质，然后经过一系列的糖基化处 理，成熟时约有230 ku，表达在胞膜上 ^[11]。VEGF 与VEGFR2结合，然后引起受体的二聚化和自身交 互磷酸化，激活下游的信号通路，调节包括细胞增 殖、迁移、存活和通透性的改变等功能。

蜜蜂毒是传统的中药，蜂毒素是蜜蜂毒的主 要成分，约占蜜蜂毒干重的50% ^[12]。既往的研究结 果显示，蜂毒素具有很高的生物活性，其在体内 外能有效的抑制骨肉瘤细胞的生长和增殖^{[2, 13]}。前 期的实验发现，蜂毒素能有效的抑制内皮细胞的 成血管作用^[3]。我们在实验中发现，蜂毒素在不高 于2 μg/ml浓度时，对EPCs无明显的细胞毒作用，但是可明显的抑制VEGF诱导的EPCs的黏附、迁移和小管形成。我们进一步实验发现，蜂毒素在 2 μg/ml浓度时，可明显的下调VEGF诱导的EPCs 的VEGFR2的表达，从而抑制EPCs成血管作用。 其可能机制是蜂毒素抑制了EPCs胞内的磷酸化作 用，影响其下游的一系列信号转导通路的激活，导致VEGFR2的合成减少，表达下降。

当然关于VEGFR2信号的转导是错综复杂的，其具体的相关转导通路和调节机制还未完全明 确，尚需进一步研究。蜂毒素对EPCs VEGFR2的 作用可能远远不止这些。本文从VEGFR2磷酸化的 角度来研究蜂毒素抑制EPCs成血管作用的机制，为研发抗肿瘤血管的药物作出了有益的提示，在 未来的抗肿瘤新生血管治疗中，蜂毒素可能起到 十分重要的作用。