膀胱癌是我国最常见的肿瘤之一，中国肿瘤 登记地区统计数据表明，我国的膀胱癌发病率呈 进行性上升，尤其在城市男性人口中，膀胱癌的 发病率持续数年稳居第六位，年标化发病率高达 13.7/105^[1]。膀胱癌患者中90%为尿路上皮癌，其中 初发患者的70%为非肌层浸润性肿瘤(non-muscleinvasive bladder cancer，NMIBC)，通过经尿道电 切和术后即刻灌注化疗药物获得治愈，但仍有20% 的高危NMIBC患者术后需要灌注卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin ,BCG）等免疫刺激剂预防肿瘤的 复发与进展^[2]。

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）属于疱疹病毒的双链DNA病毒，是一种 条件病原体，在人群中普遍存在HCMV潜伏感染。 当宿主免疫力下降时，可诱发HCMV活动性感染。 近年来，HCMV感染与人类肿瘤的发生与发展之间 的关系引起人们的关注^[3],但HCMV活动性感染与尿 路上皮癌患者的免疫功能的相关研究较少。本研究 通过检测33例患者的T细胞亚群和HCMV-IgG、IgM 抗体状态，了解两者之间的影响，为尿路上皮癌患 者的术后辅助治疗提供指导意见。 1 资料与方法 1.1 资料 1.1.1 病例资料

男24例，女9例；年龄35～85（58.2±13.2） 岁；初发患者23例，复发患者10例；有吸烟习惯者 22例；有饮酒习惯者9例；血尿33例；尿频、尿急 和尿痛15例，腰痛6例；伴有高血压6例，糖尿病2 例，冠心病1例。肿瘤组织病理分级低度恶性潜能 尿路上皮乳头状瘤9例，低级别尿路上皮癌14例， 高级别尿路上皮癌10例。33例尿路上皮癌患者的肿 瘤组织及抗凝血标本均无菌采集于安徽医科大学第 一及第二附属医院泌尿外科。本研究获得了安徽医 科大学伦理道德委员会的批准。 1.1.2 资料来源

用于流式细胞仪的CD3-PC5、CD4-FITC、CD8- PE单克隆抗体购自英国BD公司；HCMV IgG、IgM ELISA检测试剂盒购自意大利DIESSE公司。流式 细胞仪（BECKMAN COVLTER,EPICS® ALTRATM FCM with HypersortTM，美国）；高速冷冻离心机 （GL-20B，上海安亭科学仪器厂）；台式高速离 心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂）； 1.2 方法 1.2.1 流式细胞术检测尿路上皮癌患者外周血标本 CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群

每份样本检测不少于1×104个细胞，以确定T细 胞亚群的荧光强度。测定前先用标准荧光微球校准 仪器，所有标本都用同一设定条件检测。（1）取 200 μl血（肝素抗凝），分别加入20 μl CD3-PC5、 CD4-FITC、CD8-PE单克隆抗体进行染色，室温避 光孵育45 min。（2）每管中加入500μl的固定液， 室温避光孵育15 min。（3）每管中加入1ml的清 洗缓冲液，1 200 r/min离心5 min，弃除上清液。 （4）每管中加入500 μl的红细胞裂解液，室温避 光孵育15 min。（5）每管中加入1ml的清洗缓冲液 后，1 200 r/min离心5 min，弃除上清液。（6）用 缓冲液洗涤1次，加入300 μl PBS重悬细胞，上流式 细胞仪检测。 1.2.2 HCMV-IgG及IgM检测

按试剂盒说明书检测 抗凝血血浆HCMV-IgG和IgM抗体。结果判定用吸 光度法，以酶标光度仪检测各孔吸光度(OD)值，检 测波长450 nm，样品孔OD值为阴性，OD值≥2.1判 定为阳性。 1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0 进行统计学处理,计数资料采用χ²检验进行分析。 2 结果 2.1 抗凝血HCMV-IgG及IgM抗体鉴定

33份尿路上皮癌患者的血浆ELISA法检测结果 如下：HCMV-IgG阳性的为31份，阳性率为93.9% （31/33）；HCMV-IgM阳性的为7份，阳性率为 21.2%（7/33）。 2.2 流式细胞仪检测外周血T细胞亚群

根据HCMV-IgM抗体将尿路上皮癌患者分为阳 性组（7例）和阴性组（26例）。 利用流式细胞术 测定两组血标本中CD3⁺、CD4⁺ 和CD8⁺T细胞亚群的百分比。 2.2.1

阳性组血标本CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞的 百分比，见图1A~C；阴性组血标本CD3⁺、CD4⁺和 CD8⁺T细胞的百分比，见图1D~F。 2.2.2 两组间CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞比例和CD4⁺/CD8⁺比值分析

HCMV-IgM阳性组患者的CD3⁺、CD4⁺T淋巴细 胞比例显著低于阴性组，CD8⁺T淋巴细胞高于阴性 组，CD4⁺/CD8⁺ 比值低于阴性组，P值均小于0.01， 见表1。

图1 尿路上皮癌患者外周血CD3+、CD4+和CD8+T细胞流式细胞仪检测结果 Figure 1The proportion of CD3+,CD4+ and CD8+T cells in peripheral blood of urothelial carcinoma dectected by flow cytometry

表1(Table 1)

表1 尿路上皮癌患者外周血CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细 胞比例分析 Table 1 The proportion of CD3+,CD4+,CD8+T cells and CD4+⁄CD8+ in peripheral blood of urothelial carcinoma

表1 尿路上皮癌患者外周血CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细 胞比例分析 Table 1 The proportion of CD3+,CD4+,CD8+T cells and CD4+⁄CD8+ in peripheral blood of urothelial carcinoma

CD4⁺/CD8⁺ 比值正常范围为0.95~2.05，当比值 低于0.95时，通常处于免疫抑制状态。根据CD4⁺/ CD8⁺的比值可将膀胱癌患者分为细胞免疫状态正常 和细胞免疫状态异常。在HCMV-IgM阳性的7例患者 中，有6例（85.7%）CD4⁺/CD8⁺ 低于0.95，而在阴性 组中，仅有3例（11.5%）低于0.95，两组间比较差异 有统计学意义，见表2。

表2(Table 2)

表2 两组尿路上皮癌患者细胞免疫功能状态分析 Table 2 Comparison of cellular immunity of patients with urothelium carcinoma in two groups

表2 两组尿路上皮癌患者细胞免疫功能状态分析 Table 2 Comparison of cellular immunity of patients with urothelium carcinoma in two groups

HCMV 在人群中感染广泛，且具有种属特异性，即人是HCMV的唯一宿主。通常在免疫功能正 常的机体内HCMV 呈潜伏状态或低度增殖状态， 与宿主保持相对平衡状态并保持终生。当受染宿主 使用免疫抑制剂或免疫功能发育不全、免疫功能减 弱时，HCMV 的潜伏感染激活，导致病毒在宿主 细胞内增殖,对机体代谢进行多水平调节和干扰， 从而引发各种疾病。正常人体感染HCMV后产生的 HCMV-IgG抗体可以持续终生，因此IgG抗体的存 在只表明曾感染过HCMV,不一定表示有HCMV活 动性感染。HCMV-IgM通常在HCMV感染一周后产 生,持续3～5月,当病毒被机体清除或进入潜伏状态 后，HCMV-IgM亦渐消退，因此，其被用作实验室 诊断活动性HCMV感染的重要指标之一，其阳性提 示近期有HCMV活动性感染。在我国两组健康的无 偿献血人群检测中发现^{[4, 5]}，HCMV-IgG抗体阳性率 高达90%，但HCMV-IgM抗体阳性率低于3%。 在 本组33例尿路上皮癌患者中，HCMV-IgG抗体阳性 率为93%（31/33），与健康人群的发生率相近， 但HCMV-IgM抗体阳性率却达到21.2%（7/33）， 远高于健康人群的比例。

HCMV的潜伏感染与其免疫逃避机制有关^[6]， 如抑制树突状细胞( dentric cell ,DC)的抗原呈递功 能，抑制CD8⁺T 细胞和自然杀伤(natural killer,NK) 细胞介导的细胞毒作用。当机体免疫功能下降， 如AIDS、恶性肿瘤、妊娠或器官移植患者，潜伏 状态的HCMV 则可能被激活并进一步恶化机体的 细胞免疫功能。Moutaftsi 等^[7]研究发现，感染了 HCMV的DC细胞，其MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ 类分子和表面分子CD40 、CD80 都明显下降,脂 多糖诱导DC形成障碍,提示DC递呈抗原肽的能力 严重受抑。同时，研究者还发现感染了HCMV 的 机体,病毒特异性CD8⁺T 细胞增殖和细胞毒性都降 低,使感染了HCMV的细胞逃避CD8⁺T细胞的免疫 监视^[8]。

膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤，90%的患 者为非肌层浸润性尿路上皮癌(NMIBC)，保留膀胱 的经尿道电切术是治疗NMIBC的最佳方案，但术 后较高的复发率与进展率迫使临床医师寻求更加有 效的方法减少肿瘤的复发与进展^[2]，术后膀胱内灌 注化疗药物或免疫增强剂获得临床医生的重视。 BCG是目前已知的减少高风险NMIBC复发与进展 最有效的膀胱内灌注药物，并获得EUA、AUA和NCCN的推荐。与其他化疗药物不同的是^[9]，BCG 预防肿瘤复发与进展的机制是通过激活尿路上皮癌 患者体内细胞免疫系统来达到杀灭肿瘤细胞的目 的。BCG具有极强的非特异性免疫刺激活性，能 够黏附到膀胱内壁的尿路上皮细胞和肿瘤细胞，诱 导膀胱内壁产生广泛炎性反应，活化NK细胞、巨 噬细胞、Th1细胞(type l help T cell)、细胞毒性T细 胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)等多种免疫细胞 并促进这些细胞在肿瘤部位聚集，并产生包括白介 素(interleukin，IL)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)，干扰素(interferon，IFN)等细胞因子。 BCG通过T细胞、B细胞、LAK细胞、细胞因子的 相互作用达到杀伤肿瘤的目的，提示免疫系统在 抑制尿路上皮癌的发生与发展过程中具有重要的 作用。尽管BCG是目前所知最有效的生物制剂之 一，维持BCG膀胱灌注治疗可使膀胱肿瘤进展概 率降低37%，但仍有30%~45%患者对BCG膀胱灌 注治疗无效。在对BCG灌注失败的患者研究中发 现^[10]，尿液中IL-2的水平是预测BCG疗效的重要 标志物，IL-2主要由Th1细胞产生（CD4⁺），具有 刺激T细胞的生长与活化，激活NK细胞与巨噬细 胞，促进CTL细胞毒功能，研究发现尿液中IL-2浓 度越高，持续时间越长，肿瘤的复发与进展率就 越低。BCG灌注后尿液中TNF浓度也是一个重要的 预测因子^[11]，TNF由巨噬细胞、NK细胞和T细胞产 生，具有杀伤靶细胞和促进细胞凋亡的功能。

在本研究中发现，尿路上皮癌患者HCMV-IgM 阳性组和阴性组CD3⁺、CD4⁺ 和CD8⁺T细胞亚群之 间比较，差异有统计学意义（P<0.001）。阳性组 患者的CD4⁺T细胞的比例显著低于阴性组，并且 该组患者的CD4⁺/CD8⁺比值亦显著低于阴性组。 通过CD4⁺/CD8⁺的比值我们发现，阳性组中有85% （6/7）的患者处于免疫功能低下状态，而相对于 阴性组仅有11.5%（3/23）的患者处于免疫功能低 下状态。在我们前期的研究发现^[12]，HCMV活动性 感染与尿路上皮癌的病理分级和复发相关，相对于 HCMV-IgM阳性的患者，他们更易发生高级别尿路 上皮癌，术后更易发生复发与进展，对于此类患 者，术后应首选膀胱灌注BCG治疗。然而从本组 的研究结果发现，当患者处于HCMV活动性感染 状态时，其自身的细胞免疫状态功能低下，T辅助 细胞比例亦明显降低，这种改变可能会影响患者的BCG灌注治疗效果，目前尚无HCMV活动性感染 与BCG膀胱灌注疗效的相关性研究，值得我们进 一步研究。此外我们认为术前检测HCMV-IgM是一 种简单有效预测尿路上皮癌患者免疫状态的方法， 对于HCMV-IgM阳性的患者，我们认为还应辅助抗 病毒治疗，及早恢复患者的细胞免疫功能。