近年来微小RNA与自噬研究备受关注，成 为细胞生物学研究热点。它们涉及真核细胞基因 表达、发育分化、细胞凋亡、应激等多方面调 控，广泛参与生物体生长发育、免疫防御、肿瘤抑制等多种病理生理过程。已有研究表明^{[1, 2, 3, 4]}， RNA-101（microRNA-101，miR-101）在肺癌、 肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中表 达下调，可能发挥着抑癌基因的功能。而自噬是 肿瘤细胞增殖、成活的重要机制之一，对肿瘤细 胞的侵袭、转移有着重要的促进作用^{[5, 6, 7]}。本研究 以骨肉瘤组织和细胞为研究对象，检测miR-101与 自噬相关蛋白的表达，并通过脂质体转染miR-101 模拟物使其过表达，观察骨肉瘤细胞转染前、后 细胞自噬水平的改变及转染后细胞侵袭能力的变 化，探讨miR-101影响细胞侵袭能力的可能机制。 1 资料与方法 1.1 临床资料

收集2011年3月至2013年6月华中科技大学同济 医学院附属协和医院骨科手术切除的31例骨肉瘤组 织标本，并均经病理确诊。其中男18例，女13例， 年龄6~48岁，平均（22.42±9.85）岁。因放、化疗 可能会干扰肿瘤组织微小RNA的表达，故本研究 中的入选患者术前均未接受放、化疗。入选来源主 要包括：（1）肿瘤恶性程度高、范围广，无法保 肢，患者要求截肢后再化疗；（2）患者全身情况 不能耐受化疗，只行姑息性病灶切除；（3）部分 误诊患者，来诊时已不能保肢治疗；（4）外院手 术患者，局灶性复发，要求术后再化疗等。新鲜标 本切取后给予编号和登记，后置于液氮中-80℃保 存。癌旁组织取距离实体肿瘤边缘≥3 cm的骨膜组 织，经病理检查未发现肿瘤细胞。31例正常骨组织 标本来源于髋关节置换之股骨头正常骨质。所有 标本的使用均获得患者及家属知情同意。 1.2 细胞系和主要试剂

骨肉瘤细胞系MG-63由华中科技大学同济医学 院附属同济医院骨科实验室馈赠，人成骨细胞（上 海基尔顿公司），RPMI 1640培养液和胎牛血清 （美国Gibco公司），脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000 及TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）， TaqMan miRNA检测试剂盒、Real-Time PCR仪器 （美国AB公司），miR-101模拟物和阴性对照短 双链RNA（negative control）（广州瑞博生物科技 有限公司），Beclin1和LC3一抗（均为兔抗人， 英国Abcam公司），羊抗兔lgG二抗（美国Santa公 司），Transwell小室（美国Corning公司）。 1.3 细胞培养与转染

骨肉瘤细胞系MG-63采用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO₂条件下培养， 2~3 d换液1次，待细胞融合度达90%时传代，使细 胞保持对数生长状态。取对数生长期细胞接种于6 孔板并分成三组即：空白对照组（未转染组）、 阴性对照组和miR-101模拟物转染组。转染步骤参 照Lipofectamine^TM2000试剂盒说明书进行。 1.4 组织样本和细胞RNA提取

采用TRIzol法分别提取骨肉瘤组织、癌旁骨 组织、正常骨组织以及骨肉瘤细胞和成骨细胞总 RNA。紫外分光光度计测定纯度，琼脂糖电泳检 测确定RNA完整性后于-80℃下保存备用。 1.5 qRT-PCR检测

根据miRBase(http://www.mirbase.org)提供 的miRNA基因序列设计引物。miR-101正向引物 5’-TACAGTACTGTGATAACTGAA-3’，反向引物 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。U6作为内参， 其正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT- 3’，反向引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT- 3’。PCR扩增反应条件：95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，共40个循环，每组实验重复3次。 反应结束得到各标本和内参U6的基本循环数（Ct 值）。根据2^-ΔΔCt值得出miR-101的相对表达量。 1.6 Western bolt实验

常规裂解组织和细胞，考马斯亮蓝法进行蛋 白定量，电泳、转印和封闭后，分别加Beclin1抗体 （1∶500）和LC3抗体（1∶400）4℃孵育过夜。次日， 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG二抗（1∶40 000） 孵育，PBS漂洗，二氨基联苯胺（DAB）显色。Gel pro4.0凝胶光密度分析软件进行分析，同一条件下 测定目标条带累积吸光度值以及内参GAPDH累积吸 光度值，计算两者比值作为其相对蛋白表达量。 1.7 Transwell侵袭实验

骨肉瘤MG- 6 3 细胞分成三组即空白组、 miR-101模拟物组和阴性对照组。转染24 h后消化 细胞，无血清的BSA培养液重悬。以每孔2×104细 胞数加入小室，下室加含10%胎牛血清（FBS）培 养液。37℃、无CO₂培养箱培养24 h，室温下95% 乙醇固定20 min，苏木精染色10 min，三蒸水清洗 后倒置显微镜下随机选取5个视野观察照相（放大 倍数200），比较组间穿过细胞数的差异。 1.8 统计学方法

本实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS19.0统计软件进行数据分析。两组间比较采用 t检验，多组间比较采用方差分析，组间多重比较 采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-101在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中的表达

qRT-PCR检测骨肉瘤组织、癌旁骨组织和正常 骨组织中miR-101的相对表达，结果显示miR-101 在三组样本中均有表达，且骨肉瘤组织中miR-101 的表达（1.29±0.25）显著低于癌旁骨组织（3.05± 0.27）和正常骨组织（3.38±0.26），差异有统计学 意义（P<0.01），见图 1。成骨细胞miR-101的相 对表达量（2.56±0.27）是骨肉瘤MG-63细胞（1.52 ±0.20）的1.68倍（P<0.01），见图 2。

Tumor: osteosarcoma tissues; Adjacent: non-neoplastic bone tissues; Normal: normal bone tissues; *: P<0.01,compared with normal bone tissues (x±s,n=3) 图 1 qRT-PCR检测骨肉瘤组织、癌旁骨组织以及正常骨 组织miR-101相对表达量 Figure 1 Relative expression of miR-101 in osteosarcoma tissues,adjacent non-neoplastic bone tissues,and normal bone tissues measured by qRT-PCR

图选项

MG-63: MG-63 cells; *: P<0.05,compared with osteoblast (x±s,n=3) 图 2 qRT-PCR检测骨肉瘤MG-63细胞和成骨细胞miR-101 的相对表达量 Figure 2 Relative expression of miR-101 in MG-63 cells and osteoblast detected by qRT-PCR

图选项

转染48 h后收集细胞，qRT-PCR检测三组细胞 miR-101的相对表达量，分别是空白对照组（1.31± 0.32）、阴性对照组（1.35±0.31）和miR-101模拟物转染 组（3.86±0.28）。模拟物转染组miR-101表达量较空白 对照组上调了255%，差异有统计学意义（F=70.28， P<0.01）。而阴性对照组miR-101的表达和空白对照组 相比，差异无统计学意义（P=0.87），见图 3。

Blank: blank control group; miR-NC: miR-101 negative control group; miR-101: miR-101 mimics group; *: P<0.01,compared with blank control group (x±s,n=3) 图 3 qRT-PCR检测转染后三组细胞miR-101的相对表达量 Figure 3 Relative expression of miR-101 in three groups after transfection detected by qRT-PCR

图选项

Western blot检测骨肉瘤MG-63细胞和成骨细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的相对表达，结 果显示骨肉瘤细胞组Beclin1和LC3B蛋白相对表 达量均显著低于成骨细胞组，差异有统计学意义 （P<0.05），见表 1。

表 1 两种细胞Beclin1和LC3B蛋白的相对表达量 (x±s,n=3) Table 1 Relative expression of Beclin1 and LC3B in MG-63 cells and osteoblast (x±s,n=3)

表选项

转染48 h后收集细胞，Western blot再次检测三 组细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的相对表达， 结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比， miR-101模拟物转染组Beclin1和LC3B蛋白的表达 显著减低，差异有统计学意义（P<0.01）。而阴 性对照组与空白对照组比较，两自噬相关蛋白的 表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

表 2 转染后三组细胞Beclin1和LC3B蛋白的相对表达量 (x±s,n=3) Table 2 Relative expression of Beclin1 and LC3B in three groups after transfection (x±s,n=3)

表选项

转染48 h后收集细胞，Western blot再次检测三 Transwell实验表明，miR-101转染组细胞迁 移数目（56.00±9.85）较阴性对照组（116.00± 7.94）和空白对照组（123.67±9.71）分别减少了 60%和67.67%，差异有统计学意义（F=48.58， P<0.01）。空白对照组和阴性对照组比较差异无 统计学意义（P=0.35），见图 4。

*: P<0.01,compared with blank control group (x±s,n=3) 图 4 Transwell检测上调miR-101对骨肉瘤细胞侵袭性的影响 Figure 4 Effects of upregulating miR-101 expression on invasion of MG-63 cells evaluated by Transwell assay

图选项

骨肉瘤是一种好发于青少年的常见恶性成骨 性肿瘤，其恶性程度高预后差，5年生存率仅为 55%~68%^[8]，绝大多数患者最终发生了肿瘤性转 移。因此，寻找新的、有效的治疗措施，提高患者 生存率，阻止或延缓骨肉瘤的转移成为当务之急。 研究表明，微小RNA（miRNAs）具有广泛的基因 调节功能，参与生物体生长发育、细胞增殖、肿 瘤抑制等多种病理生理过程^[9]且miRNAs的表达失 调与肿瘤的发生、发展及肿瘤预后密切相关^{[4, 10]}。 Fan等^[11]研究提示正常情况下，miR-145在骨肉瘤 细胞中呈低表达状态。而应用转染技术，转染外 源性miR-145至骨肉瘤细胞，使骨肉瘤细胞过表达 miR-145则可有效阻止肿瘤血管的形成，抑制骨肉 瘤细胞的转移。Yang等^[12]研究表明在非小细胞肺癌 患者中miR-21与miR-155的异常高表达可预示患者 的肿瘤高再发率和不良预后。miR-101作为miRNAs 家族中重要成员之一，已被证实在膀胱癌、胃癌、 乳腺癌等多种实体肿瘤中呈现低表达^{[1, 2, 3, 13, 14]}，影响 着肿瘤细胞的生长和侵袭，被认为具有抑癌基因 功能。Hu等^[1]研究发现miR-101在膀胱癌组织中表 达下调，过表达miR-101可抑制癌细胞的迁移和侵 袭。本研究中，qRT-PCR结果显示在骨肉瘤组织和 骨肉瘤细胞系，miR-101的表达均显著下降，提示 miR-101可能参与了骨肉瘤的发生、发展，影响着 骨肉瘤细胞的生长和侵袭。

自噬作为细胞在异常环境中维持生存的一种 方式，对肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移同样起着 重要的调节作用^{[5, 6, 7, 15]}。Zhang等^[16]研究表明自噬与 骨肉瘤的发生密切相关，抑制自噬可增强骨肉瘤 细胞对化疗药物的敏感度。自噬和miR-101均与肿 瘤细胞的侵袭密切相关，但两者对骨肉瘤细胞的 影响鲜见报道。本研究中，Transwell侵袭实验表 明，模拟物转染组骨肉瘤细胞迁移的数目明显低 于空白及阴性对照组，提示miR-101对骨肉瘤细胞 的迁移有明显的抑制作用，可延缓或阻止肿瘤细 胞转移。Western blot结果显示，miR-101转染组 细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的表达与空白组 和阴性对照组相比显著减低，表明miR-101不仅可 抑制骨肉瘤细胞的侵袭还同时降低了骨肉瘤细胞 的自噬水平，这一结果与已有的研究发现保持一 致。Frankel等^[17]通过对乳腺癌细胞系MCF-7细胞 转染真核LC3质粒，量化细胞自噬体形成百分比以 及敲除Beclin1基因，证实miR-101具有显著的抑制 自噬作用。Xu等^[18]在对肝细胞癌细胞系的研究中 也发现miR-101可明显抑制自噬，增加顺铂诱导的 癌细胞凋亡。故我们推测本实验中miR-101抑制骨 肉瘤细胞侵袭很可能也是通过了抑制骨肉瘤细胞 自噬而发挥作用。

综上所述，miR-101可有效抑制骨肉瘤细胞侵袭 和自噬且可能是通过降低细胞自噬而影响癌细胞侵 袭性，但具体分子机制仍不明确，有待进一步研究。 随着对miR-101及自噬的深入探索，其有望成为骨肉 瘤治疗的新靶点，为骨肉瘤的治疗提供新思路。