过继性免疫治疗是一种行之有效的肿瘤治疗 方法，但临床上常常会陷入困境，原因和回输体 内的效应细胞归巢存留时间短、杀伤效率低和肿 瘤免疫耐受等有关^{[1, 2]}。肿瘤微环境中高水平的调 节性T细胞（regulatory T cells,Treg）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）和转化生长因子-β （transforming growth factor beta,TGF-β）被认为 是诱导肿瘤免疫耐受的重要因素^[3]。如何有效下调 这些免疫抑制因素，改善效应细胞瘤体内存留分 布和杀伤效率对于提高肿瘤免疫疗效十分重要。

环磷酰胺（cyclophosphamide,CYC）是一种 常用的细胞毒化疗药物，同时也是一种免疫抑制 剂。有研究证明^[4]，单次小剂量CYC在数量上及功 能上都具有抑制Treg作用，但不能延缓肿瘤生长。 而有关CYC应用在降低Treg同时，是否也能降低 IL-10和TGF-β等免疫抑制因子，改善效应细胞体 内分布和功能则未见报道。因此，我们采用低剂 量CYC腹腔注入对C57BL/6荷黑色素瘤小鼠体内 微环境进行提前干预，利用荧光染料2-羧基荧光 素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）标记抗原特异 性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）回输小鼠体内，以探讨应用低剂量CYC对 瘤体内Treg、IL-10和TGF-β影响以及对改善过继回 输的CTL瘤体内归巢聚集和杀伤功能的重要作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物和肿瘤细胞

恶性黑色素瘤细胞（B16细胞）株购自中国 科学院上海细胞库。置于含10%灭活FBS、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI 1640培养 液中，于37℃、5%CO₂保湿培养箱中培养。健康 C57BL/6小鼠均为雌性，6~8周龄，体重18~20g， 购自河北省实验动物中心[SPF级，许可证编号： SYXK（冀）2008-0026]。 1.2 方法 1.2.1 肿瘤全抗原制备和负载于树突状细胞 （dendritic cell,DC）

收集对数生长期B16细胞， 调整浓度至2×10⁷个/毫升，快速冷冻至-80℃， 于37℃水浴复温，循环4次，10000 r/min 离心15 min，收集上清液，于－80℃冻存备用。颈椎脱位 法处死小鼠，无菌取股骨和胫骨。以RPMI 1640冲 洗收集骨髓，1 500 r/min离心5 min。弃上清液， 裂解红细胞，细胞按1×10⁶/ml浓度分至6孔培养 板中，加入rmGM-CSF（20 ng/ml）、rmIL-4（20 ng/ml）。第6天按每毫升培养液加入120 μg B16细 胞裂解蛋白，4 h后再加入rmTNF-α（15 ng/ml）， 培养至第7天，收集悬浮细胞即为负载肿瘤抗原的 DC。 1.2.2 抗原特异性CTL制备

制备小鼠脾脏淋巴细 胞悬液，依据Mouse CD3⁺ T Cell 磁珠分选试剂盒说 明提取CD3⁺ T细胞，培养2天后加入负载肿瘤抗原的 DC（DC:T=1:20），同时补充 rmIL-2（20 ng/ml）， 置37℃、5%CO₂培养箱中混合培养3~4天，DC将 所负载的肿瘤抗原信息提呈给T细胞，使之激活并 进一步扩增。 1.2.3 CFSE对CTL荧光标记和CD8⁺CTL检测

用一瓶50 μg CellTrace^TM CFSE溶于18 μl DMSO中，制备5 mmol/L CFSE贮存液。重悬CTL 于37℃预温的含5%胎牛血清的PBS，细胞浓度≤ 50×10⁶/ml，反应体系为1 ml。放平干燥的试管，

将110 μl PBS加入试管头端干燥部分，并将1.1 μl 5 mmol/L的CFSE重悬其中，使终浓度为5 μmol/L。 37℃孵育10 min。加入5倍体积4℃冷PBS，终止 染色。冰上孵育5 min。1 500 r/min离心沉淀细胞5 min。含5%胎牛血清的新鲜培养液洗2次。回输时 用不含血清的培养液重悬细胞。流式细胞仪，激 发波长488 nm进行检测，同时荧光显微镜观察。 将100 μl染色后CTL重悬，调整浓度为1×10⁷个/毫升， 加1 ml新鲜破膜工作液，暗处4℃孵化30 min；2 ml破 膜缓冲液洗涤细胞，2 500 r/min离心5 min，弃上 清液；重复操作后，加入0.5 μg Fc受体封闭破膜缓 冲液，体积调整至100 μl，4℃放置15 min；加入 0.5 μg小鼠PE-Cy5-CD8⁺抗体，暗处4℃孵化30 min；用 2 ml破膜缓冲液洗涤细胞，3 500 r/min离心5 min， 弃上清液；重复后悬浮细胞，流式细胞学检测 CD8⁺CTL比例。 1.2.4 C57BL/6小鼠黑色素瘤模型建立和分组

取对数生长期B16细胞，0.25%胰蛋白酶消 化，调整浓度至5×10⁵/ml，取瘤细胞悬液0.2 ml 皮下接种于小鼠颈后区域，7天后皮下可及直径 约5 mm左右质硬黑色结节，界限清楚，视为建 模成功。将模型鼠分为四组：CYC注入组（CYC injection group,CYCI），0.9%NaCl溶液注入+CTL 回输组（the solution of 0.9% w/v of NaCl injection plus CTL infusion group,NSI+CTL），CYC注入 +CTL回输组（CYC injection plus CTL infusion group, CYCI+CTL）和对照组（不实施任何治疗干预组）。 分别于建模成功时对CYC组和CYCI+CTL组小鼠进 行单次CYC腹腔注入（20 mg/kg）^[4]，同时NSI+CTL 组小鼠单次注入等体积的0.9%NaCl溶液。各组置无 菌净化屏障系统内饲养，每三日测量肿瘤结节最长 径a和最短径b，根据公式V=1/6π（ab²）计算体积，绘 制肿瘤生长曲线。 1.2.5 小鼠肿瘤内Treg、IL-10和TGF-β水平检测

NSI+CTL和CYCI+CTL两组小鼠分别于CYC或 0.9%NaCl溶液注射前（d0）和注射后d1、d4、 d7、d11及d15各时间点脱颈处死，无菌收集2 mm³ 肿瘤组织加入预冷的0.9%NaCl溶液中，清洁表面血 迹，加入组织裂解液50 μl，放入含冰块烧杯，用细胞 超生粉碎仪进行匀浆，直至充分裂解，10 000 r/min 离心5 min后取上清液，分装并置于－20℃保存。 按小鼠Treg流式检测试剂盒说明书对所收集细胞进 行CD4（FITC）CD25（PE）foxp3（PE-cy5）三 标染色后检测瘤体内Treg水平。ELISA法检测小鼠 肿瘤分离上清液中TGF-β和IL-10在注射前后水平 变化，按试剂盒说明书方法进行。 1.2.6 回输CTL瘤体内归巢聚集检测

CYC或NS 注射后第4天，分别经以上两组小鼠鼠尾静脉回输 培养的CFSE-CTL，每只0.2 ml，含5×l06个细胞。分 别于CTL回输后不同时间点（6 h、1 d、3 d、6 d、 10 d、15 d、21 d）脱颈处死小鼠。解剖并称取1 g 重不同时间肿瘤组织，清除脂肪组织后剪碎。置 于200目不锈钢细胞筛上适度研磨，分离收集细 胞。裂解红细胞，Hank’s液洗涤2次，1 000 r/min 离心5 min后弃上清液，RPMI 1640液重悬，调整 浓度至1×10⁷/ml。取单细胞悬液1 ml，与Hank’s液 1∶1混匀，加入2 ml小鼠淋巴细胞分离液，1 500 r/min 离心15 min，取淋巴细胞液层，洗涤2次，流式细 胞仪，激发波长488 nm检测CFSE-CTL阳性细胞比 例。红细胞、细胞碎片通过前向角光散射和对侧 向角光散射分析设定门值排除。同时分别切取两 组CTL回输后不同时间肿瘤组织迅速放置于OCT包 埋剂中，制备15 μm厚冰冻切片，激光共聚焦显微 镜观测肿瘤组织内CFSE阳性细胞分布情况。 1.3 统计学方法

各组数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SAS（V8）软件程序进行统计处理，采用t检验、 单因素方差分析和重复测量方差分析确定差异显 著性，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 CFSE对CTL荧光标记和CD8⁺ CTL检测

利用CFSE对CTL标记后，荧光显微镜下观 察，发现CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞 质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强。倒置显 微镜下对CTL进行对比观察，发现染色率几乎达 100%，见图 1A、1B。加入小鼠CD8⁺抗体，流式细 胞学检测CD8⁺ CTL比例，达到41.7%，见图 1C。

A: CTLs were labeled with CFSE at 5 μmol/L (×1000); B: Fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry; C: The ratio of CD8+ CFSE-CTLs was analyzed by flow cytometry; CTLs: cytotoxic T lymphocyte; CFSE: 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester 图 1 CTLs荧光标记和流式细胞学分析 Figure 1 Fluorescence labelingand flow cytometry analysis of CTLs

图选项

NSI+CTL组小鼠瘤体内Treg、IL-10和TGF-β水 平均随着肿瘤体积增长而逐渐增高；CYC+CTL组 小鼠瘤体内Treg（P=0.004）和IL-10（P=0.002） 水平均于CYC注射后第4天显著降低，与对照组相 比差异有统计学意义，见图 2A、2B，以后逐渐提 升；CYC组小鼠瘤体内TGF-β水平则推迟至CYC注 射后第7天时降低至最低水平，与对照组相比差异 有统计学意义（P=0.003），见图 2B。

A: Flow cytometry charts of Tregs in tumors at the different time points after CYC or the solution of 0.9% w/v of NaCl injection between CYCI+CTL group and NSI+CTL group; B: Comparison of the levels of Treg,IL-10 and TGF-β in tumors at the different time points after CYC or NS injection between the two groups; CYC: cyclophosphamide; CYCI: cyclophosphamide injection; NSI: the solution of 0.9% w/v of NaCl 图 2 CYCI+CTL和NSI+CTL两组CYC/0.9%NaCl溶液应用后各时间点Treg、IL-10、TGF-β水平比较 Figure 2 Comparison of Treg,IL-10 and TGF-β levels at the different time points after CYC or the solution of 0.9% w/v of NaCl injection between CYCI+CTL group and NSI+CTL group

图选项

CTL回输后6h~d1,两组均显示肿瘤组织中 较多的CFSE-CTL聚集。d3~d15，两组间CTL分 布模式出现差异：CYCI+CTL组肿瘤内表现为较 多的CFSE-CTL聚集分布，且持续时间较长，达 6~10天；而NSI+CTL组肿瘤组织,则表现为较少 的CFSE-CTL分布聚集，持续时间短，3天之后迅 速减少。d21，NSI+CTL组肿瘤组织中CFSE-CTL 几乎消失；而CYCI+CTL组，肿瘤组织中仍可见到 CFSE-CTL分布。统计分析显示肿瘤组织中CFSECTL 阳性细胞比例在CYCI+CTL组比NSI+CTL组明 显增多，且富集时间较长（P=0.009），见图 3A、3B。

A: Comparison of morphological distribution of CFSE-CTLs in tumors between CYCI+CTL group (up) and NSI+CTL group (down) (LSCM ×100); B: Comparison of CFSE-CTLs ratio in tumors between the two groups 图 3 CYCI+CTL和NSI+CTL两组回输的CFSE-CTLs肿瘤内归巢分布比较 Figure 3 Comparison of transfused CFSE-CTLs homing between CYCI+CTL group and NSI+CTL group

图选项

计算各组不同时间点肿瘤体积并进行比较。 采用重复测量方差分析显示：CYCI组和对照组之 间差异无统计学意义（P=0.648）；其余各组之 间差异均有统计学意义（P<0.05）；NSI+CTL组 和CYCI+CTL组相比，免疫治疗早期，两组间肿 瘤体积差异无统计学意义（P>0.05），自回输后 第3天始，两组间肿瘤体积差异均有统计学意义 （P<0.001），肿瘤抑制效果差异自CTL回输后第 6~15天尤为显著，见图 4。

图 4 CTLs回输后各组抗肿瘤效果比较 Figure 4 Comparison of anti-tumor effect after CTLs infusion among every group

图选项

肿瘤微环境中复杂多变的免疫抑制网络限制 了肿瘤过继性免疫治疗的实际效果，其中的免疫 抑制因素是困扰免疫治疗的关键。近年来随着肿 瘤免疫基础研究的发展，虽然仍未完整阐明肿瘤 的免疫抑制网络，但其中重要节点-Treg细胞和细 胞因子TGF-β、IL-10的作用日益受到重视^{[5, 6]}。

肿瘤微环境Treg比例增加，导致肿瘤免疫失 调，去除这群细胞可有效诱导肿瘤免疫^[5]。动物实 验表明，肿瘤微环境中激活的TGF-β诱导的免疫 抑制是保护肿瘤细胞逃脱机体免疫系统监视的最重要因素，TGF-β是肿瘤免疫逃逸的最主要调控 者^[7]。而当机体发生肿瘤时，IL-10水平会异常升 高。Treg可通过分泌TGF-β、IL-10等因子抑制效应 T细胞和DC功能^[8]。TGF-β可诱导Treg扩增，而扩 增的Treg又可进一步分泌TGF-β^[8]。可见，Treg、 TGF-β和IL-10在肿瘤微环境中相互影响和作用， 诱导了肿瘤的免疫耐受。而寻找消除这些免疫抑 制因素的新方法，成为肿瘤免疫治疗领域研究的 重要课题。

已有报道低剂量CYC能降低和抑制正常小 鼠Treg细胞数目和功能，其机制可能是通过抑制 Treg增殖并且增强其凋亡敏感度而实现的^[9]。因 为Treg、TGF-β和IL-10这三种免疫抑制因素的密 切关联作用，低剂量CYC有可能抑制Treg同时， 对肿瘤微环境中的TGF-β和IL-10水平也会产生影 响，从而有可能打破肿瘤免疫耐受，调控效应细 胞在瘤体内的存留分布和功能效应。本实验中利 用低剂量CYC腹腔注射，发现在降低荷瘤小鼠体 内Treg同时，TGF-β和IL-10水平也同时下降。分 析其原因，可能是小剂量CYC引致体内Treg水平 下降，后者会导致TGF-β、IL-10的分泌下降，另 一方面，Treg水平下降又会破坏肿瘤免疫抑制， 引致肿瘤产生IL-10下降；而IL-10下降又能导致无 能T细胞产生TGF-β下降。因此出现Treg、IL-10和 TGF-β水平的同时下降，从而破坏了肿瘤免疫耐 受，以利于回输的CTL充分发挥其杀伤效应。进一步研究发现，Treg和IL-10在注射后第4天降低最 明显，而TGF-β则较为延迟，于用药后第7天降低 较明显，这就提示低剂量CYC提前应用提供了免 疫治疗的最佳“窗口期”，即CYC干扰微环境后4~7 天实施CTL回输治疗，治疗效果应当最佳。

过继免疫治疗细胞经外周静脉途径输注后在 活体内分布迁徙规律的研究，目前主要集中在细 胞可以分布的器官、可否归巢于淋巴循环以及是 否对肿瘤组织选择性富集^[10]。本研究发现，CYC 干扰微环境组较对照组回输的CTL在肿瘤组织中 归巢聚集明显且存留时间长，低剂量CYC可以明 显改善效应细胞在肿瘤内的存留分布。

但是实验中发现单纯的低剂量CYC应用并不 能产生明显地抑瘤作用，还需要抗原特异性效应 细胞CTL的回输才能发挥有效作用。在利用低剂 量CYC干扰肿瘤免疫微环境，摆脱免疫耐受的基 础上，回输的CTL对肿瘤的杀伤效率才得以明显 提高，肿瘤体积生长明显减缓，这种趋势愈近治 疗后期愈明显。当然，CTL回输体内后对肿瘤的 杀伤作用十分复杂，诸如各种杀伤介质的蛋白表 达水平变化，肿瘤细胞的凋亡坏死等，因此其具 体机制还需要进一步深入研究。