胃癌是最为常见的恶性肿瘤之一，其致死率 占全世界癌症死亡率的10%以上，是癌症导致死 亡的第二个最常见原因^[1]。目前胃癌最常用的治疗 方法是手术、放疗和化疗，以及根据不同病程的 综合治疗，而化疗是目前治疗胃癌的重要手段之 一，但由于胃癌细胞容易对化疗药物产生多药耐 药性，所以常常导致胃癌化疗的效果很不理想。

胃癌多药耐药产生的分子机制有多种，研究 表明ABCC4蛋白的异常表达可能与胃癌多耐药关 系密切，因此，本课题主要阐述ABCC4基因对胃 癌多药耐药的发生及进展的影响。

人胃黏膜上皮细胞GE S - 1 、人胃癌细胞 MGC-803、人胃腺癌细胞SGC-7901及多药耐药 细胞SGC-7901/Fu均购自美国ATCC。ABCC4、 P-gp、Bax、Bcl-2、CDK4和Cyclin D1抗体均购 自Abcam公司（美国），PI购自Sigma公司（美 国），siRNA由GenePharma公司（上海）合成， RT-PCR试剂盒（TaKaRa RNA PCR Kit（AMV） Ver.3.0）购自宝生物有限公司。

人胃黏膜上皮细胞GE S - 1 、人胃癌细胞 MGC-803、人胃腺癌细胞SGC-7901用含10%胎牛 血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO₂的培养箱中进行培 养。SGC-7901/Fu细胞需要在上述培养液中加入20 μg/ml 5-Fu，以维持细胞的耐药性。待细胞长至对数生长期进行实验。

将SGC-7901/Fu细胞接种于96孔培养板中，待细 胞生长至对数期。每孔加入20 μl MTT (0.5 mg/ml)， 于37℃条件下孵育4 h，待黄色染液转变成蓝色结 晶后，除去培养液，每孔加入150 μl DMSO，使蓝 色结晶充分溶解。酶联免疫检测仪在490 nm处检测 各孔的吸光度A值（A_{490 nm}）。实验设24、48、72、 96、120 h五个时间组，每组设8个平行孔。

将细胞常规接种于6孔培养板中，待细胞长至 70%融合度后进行转染。实验设SGC-7901/Fu细胞 组（Control组）、转染空质粒组（N-control组）和 ABCC4基因沉默组（RNAi组）。更换不含血清及 双抗的RPMI 1640培养液，加入1.5×10⁹ TU/ml病毒 4 μl进行转染（靶向人ABCC4基因的RNAi重组慢 病毒载体LV-shRNA-ABCC4为本实验室在前期工 作中构建），并向各孔加入聚凝胺（Polybrene）。 病毒感染12 h后，更换含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养。RNA干扰效率用RT-PCR和 Western blot进行检测。

提取各组细胞总R N A ，提取步骤参照 RNAisoTM Plus（TaKaRa,日本） 说明书。 计算浓度后，使用RT-PCR试剂盒（TaKaRa， 日本）进行RT-PCR反应，步骤参照说明书。 ABCC4、MDR1、β-actin引物由Invitrogen公司 合成。ABCC4上游引物：5'-CGCGTGTTCTT CTGGTGGCTC-3'，下游引物：5'-CTTTATC CCAGAACCCTTGC-3'；MDR1上游引物：5'- CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物： 5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；β-actin上游 引物：5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'，下 游引物：5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'。 PCR反应体系50 μl，反应条件：94℃ 2 min，94℃ 变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个 循环。得到的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳， 并使用凝胶成像系统进行扫描分析。

收集各组细胞并制备成单细胞悬液。按照凋 亡试剂盒（Annexin-V-FITC Kit，BD公司，美 国） 说明书步骤，分别加入Annexin-V和PI，室温 避光染色20 min，流式细胞仪（Becton-Dickinson, USA）进行检测。

收集各组细胞并制备成单细胞悬液。70%的冷 乙醇4℃固定过夜。加入1 ml PI染液（含RNase 10 μg，Triton X-100 5 μl），4℃避光染色30 min，流式细胞仪（Becton-Dickinson,USA）检测细胞周期。

收集各组细胞，按Caspase活力检测试剂盒 （碧云天公司，中国）的操作方法测定Caspase-3， Caspase-8，Caspase-9的活力。用荧光分光光度计 在激发波长400 nm，发身波长505 nm下进行测定。

收集实验各组细胞，加入2 ml细胞裂解液（50 mM Tris-HCl，137 mM氯化钠，10% 甘油，100 mM 钒酸钠，1 mM PMSF，10 mg/mL抑肽酶， 10 mg/ml亮肽素，1% NP-40，5mM cocktail；pH 7.4）裂解细胞。BCA法测定蛋白质浓度。每孔加 入等量蛋白质，进行SDS-PAGE。半干法进行转 膜，封闭过夜。洗膜后加入一抗孵育2 h，TBST洗 膜，加入二抗孵育2 h。加入化学发光试剂，X片 曝光显像，扫描条带，并进行灰度分析。

动物实验方案获得桂林医学院医学伦理学委 员会通过。裸鼠购于桂林医学院动物实验中心， 共20只，雄性，6~8周龄，体重约25 g。随机分成 2组，每组10只，分别在皮下注射N-Control组及 RNAi组细胞。每只注射5×10⁵个细胞，每日观察裸 鼠生长情况。4周后颈椎法处死裸鼠，无菌条件下 切取皮下移植瘤组织进行检测。

采用SPSS16.0软件进行统计学处理。全部数 据均以均数±标准差（x±s）表示，各实验组间比 较采用单因素方差分析和LSD-t检验。P＜0.05为差 异有统计学意义。

实验发现，ABCC4 mRNA在MGC-803细 胞，SGC-7901细胞和SGC-7901/Fu细胞中的表 达水平均高于GES-1细胞，差异有统计学意义 （P<0.05），特别是以SGC-7901/Fu细胞中的 ABCC4 mRNA表达水平增高最为显著。同时， Western blot分析ABCC4蛋白在上述4种细胞中的表 达水平与ABCC4 mRNA的表达水平基本一致。结 果说明，人胃癌多药耐药SGC-7901/Fu细胞中存在 高水平的ABCC4基因和蛋白表达 ，见图 1。

A: the expression level of ABCC4 gene in 4 cells by RT-PCR; B: the expression level of ABCC4 protein in 4 cells by Western blot 图 1 ABCC4 在GES - 1 、MGC- 8 0 3 、SGC- 7 9 0 1 及 SGC-7901/Fu细胞中的表达 Figure 1 ABCC4 expression in GES-1,MGC-803, SGC-7901 and SGC-7901/Fu cells

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实验发现，感染4天后，ABCC4 mRNA表达水 平与对照组和N-Control组相比显著下调，同时， ABCC4蛋白表达水平也会显著下调 ，差异有统计 学意义（P<0.05），见图 2。

A: the expression level of ABCC4 gene in SGC-7901/Fu cells that was silenced by RNA interference; B: the expression level of ABCC4 protein by Western blot 图 2 RNA干扰沉默SGC-7901/Fu细胞中ABCC4的表达 Figure 2 ABCC4 expression in SGC-7901/Fu cells silenced by RNA interference

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流式细胞仪分析结果发现，RNA干扰沉默 ABCC4基因，给予5-Fu治疗后SGC-7901/Fu细胞 的凋亡率较其他各治疗组明显增高，见图 3A。 Caspase-3及Caspase-9表达水平也明显增加，见图 3B。此外，Western blot分析结果发现，Bax蛋白 表达显著增加，而Bcl-2蛋白表达降低，见图 3C、3D。这些结果证实，沉默ABCC4基因可以增强 5-Fu诱导SGC-7901/Fu细胞发生凋亡的能力。

A: SGC-7901/Fu cell apoptosis detected by flow cytometry; B: detection of Caspase-3 and Caspase-9 activity; C,D: the expression levels of Bax and Bcl-2 protein detected by Western blot in SGC-7901/Fu cell after silencing ABCC4; *:P＜0.05,means 5-Fu+RNAi group was statistically significant difference than other groups 图 3 沉默ABCC4基因增强5-Fu诱导胃癌多药耐药SGC-7901/Fu细胞凋亡 Figure 3 Silencing ABCC4 gene enhanced the apoptosis of SGC-7901/Fu cells

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流式细胞仪对细胞周期的检测结果发现， 单独给予5-Fu或RNA干扰治疗并不能改变细胞周 期的分布状态。然而，当沉默ABCC4基因的同 时给予治疗剂量的5-Fu则会使被阻滞在G₁期内的 SGC-7901/Fu细胞数量显著增加，见图 4A。同时， 进一步检测细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表达 水平，经Western blot分析发现，5-Fu+RNAi组的 Cyclin D1和CDK4蛋白表达水平显著降低，见图 4B、4C。Cyclin D1和CDK4蛋白在G₁期调控中发 挥着不可替代的作用，研究表明，沉默ABCC4基 因增强5-Fu抑制胃癌多药耐药SGC-7901/Fu细胞增 殖可能是通过下调Cyclin D1和CDK4蛋白表达水 平，从而导致细胞周期被阻滞在G₁期而实现的。

A: cell cycle changes detected by flow cytometry; B,C: the expression levels of cycle protein Cyclin D1 and CDK4; *:P＜0.05,means 5-Fu + RNAi group was statiscally significant difference than other groups 图 4 沉默ABCC4基因增强5-Fu诱导胃癌多药耐药SGC-7901/Fu细胞周期阻滞 Figure 4 Silencing ABCC4 gene enhanced SGC-7901/Fu cell cycle arrest

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动物实验方案获得桂林医学院附属医院伦 理委员会讨论通过。常规建立裸鼠皮下移植瘤 模型，并分组给予ABCC4基因RNA干扰试剂和 5-Fu。发现在任何时间段，5-Fu+RNAi组的肿瘤体 积均显著小于N-Control组。同时，手术切取肿瘤 的重量在5-Fu+RNAi组也显著小于N-Control组， 见图 5。本研究结果提示沉默ABCC4基因在体内也 能明显逆转人胃癌多药耐药性。

A: tumor tissues from operation resection after inoculated for 29 days; B: tumor volume measured at different time pointes after inoculation; C: the tumor weight of two groups after inoculated for 29 days; *: P＜0.05,compared with N-control group 图 5 沉默ABCC4基因抑制裸鼠移植瘤生长 Figure 5 Silencing ABCC4 gene inhibited the growth of transplanted tumor in nude mice

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P-gp（MDR1）转运蛋白水平的检测结果发 现，沉默ABCC4基因后MDR1基因的表达水平随之下降，并且P-gp转运蛋白的表达水平也随之降 低，差异有统计学意义（P<0.05），见图 6。本 研究结果说明沉默ABCC4基因增加胃癌多药耐药 SGC-7901/Fu细胞对5-Fu的化疗敏感度可能与下调 P-gp（MDR1）转运蛋白相关。

A: MDR1 gene expression level detected by RT-PCR; B:The expression level of P-gp protein detected by Western blot 图 6 沉默ABCC4基因通过MDR1逆转胃癌多药耐药 SGC-7901/Fu细胞对5-Fu的敏感度 Figure 6 Silencing ABCC4 gene reversed the sensitivity of SGC-7901/Fu to 5-Fu by MDR1

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ABC转运蛋白家族4（ABCC4）是ABC 转 运蛋白家族成员，又称多药耐药相关蛋白4 （MRP4）。ABCC4最先被发现于前列腺上皮细胞 的基底膜。ABCC4在人类中定位于染色体13q32， 全长约312 kb，含有31个外显子，编码1 325个氨 基酸^[2]，是耐药基因家族成员之一。ABCC4的结 构具有一定的特异性，它缺失N端的一个跨膜结 构域，形成MSD1-NBD1-MSD2-NBD2的结构， 是ABC家族中结构最简单的蛋白。ABCC4能向 胞外转运多种结构不同的内源性和外源性有机阴 离子，ABCC4的这种特性赋予细胞耐受细胞毒性 复合物，保护重要组织免受异型生物质侵害的功 能，同时也影响细胞中药物的代谢，从而产生抗 药性。

近年来ABCC4与肿瘤的关系已成为研究的热 点，Dong和Cai等^{[3, 4]}发现ABCC4在通过雄激素诱 导的前列腺癌细胞中高表达，随后的研究进一步 证实了ABCC4 mRNA在前列腺癌中过度拷贝^[5]。 本研究发现ABCC4基因及蛋白在多种人胃癌细胞 以及胃癌耐药细胞中表达水平升高，特别是在人 胃癌耐药细胞中的表达水平升高最为显著。这意 味着ABCC4与人胃癌耐药的发生发展过程有着某 种密切的联系，很可能是一个潜在的胃癌耐药的 治疗靶点。为了进一步阐明ABCC4是否与人胃癌 耐药的发生发展存在关联及其详细作用机制，本 研究结果发现，下调ABCC4后人胃癌耐药细胞增 殖受到抑制，细胞发生凋亡，细胞周期被阻滞在 G₀/G₁期以内。同时，裸鼠体内的移植瘤生长受到 抑制。上述现象说明ABCC4在人胃癌耐药细胞中 的高表达状态促进了肿瘤细胞的增殖。既往的研 究也表明，ABCC4的高表达对胰腺癌、卵巢癌等 恶性肿瘤均具有促进作用。这充分证明了ABCC4 在人胃癌耐药细胞的增殖过程中同样发挥了重要的调控作用。

然而，至今为止，尚不清楚ABCC4是如何调 控人胃癌耐药细胞增殖抑制过程的。随后本研究 从细胞凋亡和细胞周期进程等方面进行了探讨， 发现通过下调ABCC4可导致人胃癌耐药细胞发生 凋亡，而Dai等^[6]研究发现，ABCC4可通过调控 mTOR信号转导通路从而调控细胞凋亡。这些结 果与本研究较为一致。而进一步的研究发现，下 调ABCC4抑制人胃癌耐药细胞增殖与细胞发生凋 亡密切相关。同时，下调ABCC4可将人胃癌耐药 细胞周期阻滞在G₀/G₁期以内。上述现象说明， ABCC4在人胃癌耐药细胞中的高表达水平是肿瘤 细胞增殖所必需的，若下调ABCC4可导致人胃癌 耐药细胞增殖抑制。

既往大量研究证实，线粒体通路和死亡受体 通路^[7]是许多肿瘤细胞发生凋亡的经典途径。Bcl-2 和Bax在线粒体凋亡途径中发挥着关键作用^{[8, 9]}。若 Bax从胞质移位到线粒体膜上，则可改变线粒体膜 的通透性，促进细胞色素C从线粒体释放入进入胞 质，继而启动Caspase家族活化及级联放大作用， 最终导致细胞发生凋亡^{[10, 11, 12]}。在本研究中发现，人 胃癌耐药细胞中下调ABCC4可导致Bax和Bcl-2发生 移位，Caspase-3和Caspase-9表达水平明显升高。推 测，线粒体途径细胞凋亡时，细胞色素C释放进入 胞质内可能产生活化Caspase-9和Caspase-3的生物 学效应，从而在细胞凋亡途径中扮演关键的作用。 上述结果证实，下调ABCC4可诱导人胃癌耐药细 胞发生凋亡，并且可能与线粒体途径密切相关。

目前认为恶性肿瘤耐药的发生与肿瘤细胞膜 上的MDR1基因及P糖蛋白的异常表达增加密切相 关，因此有研究者提出，通过各种方法促进两者 的表达下调，就有可能使肿瘤细胞发生耐药性的 概率降低^{[13, 14]}。不可否认，MDR1基因及P糖蛋白 的异常表达往往与肿瘤细胞耐药性的产生紧密相 连。既往研究表明，应用不同的方法使肿瘤耐药 细胞内的MDR1基因及P糖蛋白表达下调，可抑 制肿瘤细胞的耐药性产生^[15]。本研究发现，下调 ABCC4的同时给予治疗剂量的5-氟尿嘧啶能够明 显抑制人胃癌耐药细胞增殖及周期进程，并使裸鼠体内肿瘤细胞的生长受到抑制。同时，肿瘤细 胞膜上的MDR1基因及P糖蛋白的表达水平亦明显 降低。上述结果说明，下调ABCC4可通过改变细 胞膜MDR1和P糖蛋白表达水平从而抑制人胃癌耐 药细胞的增殖。

本研究发现ABCC4在人胃癌耐药细胞中呈高 度表达，下调ABCC4可通过调节Bcl-2/Bax作用于 线粒体途径从而诱导人胃癌耐药细胞发生凋亡， 导致细胞周期发生阻滞，并且能增强胃癌耐药细胞 对5-Fu的敏感度。它在未来可能会成为一种新的治 疗方法，为胃癌耐药的临床治疗提供理论依据。